杂交瘤技术-中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.11.7.14 单克隆抗体研制最详细步骤（2 ） 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然 结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其 多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细 胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975 年 8 月 7 日，Kohler 和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性 抗体的融合细胞的持续培养” （Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity ）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的 融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase ，HGPRT ）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾 细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤 （hypoxanthine ，H ）、氨基喋呤（aminopterin，A ）和胸腺嘧啶核苷（thymidine ， T ）的培养基（HAT ）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的 正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+ ，但不能连续培养，只能在培养基中 存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不 能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分 别来自亲本脾细胞的HGPRT 和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在 HAT 培 养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵 羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即 所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗 体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早 仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG ）的融合效果更好，且避免了 病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653 和NSO/1 都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生 的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞 MOPC-21 等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细 中国试剂网 3.11.7.14 胞系，但其基本原理和方法是一样的。 （二）基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是 作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪 器设备：超净工作台、CO2 恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精 密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min ）、37℃水浴箱、纯 水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml 细胞培 养瓶，10ml、1ml 刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、 250ml 、100ml 盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml 注射器等，96 孔、24 孔 细胞培养板，融合管（50ml 圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊， 血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul ，~200ul ，~1000ul ），弯头针头，200 目 筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测 单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选 与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1 概括了淋巴细 胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。 1、动物免疫 (1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯 度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因