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分子实验中核算DNA 提取常见问题及分析 一、基因组DNA 提取常见问题分析 1．样品材料老化或反复冻融导致DNA 含量下降： 应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩 的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C 低温保存，以免DNA 降解。 2 ．样品破壁或裂解不完全，DNA 未充分释放： 动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样 品应用溶菌酶、Lyticase 酶或机械方式协助破壁。 3 ．样品量过多导致细胞裂解不充分： 加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。不同来源样品 的加样量不同。 4 ．DNA 吸附不充分： 如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再 上吸附柱使DNA 与硅胶膜充分吸附。 5 ．DNA 洗脱不适当： 洗脱缓冲液pH 值过低会阻碍DNA 从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5 之间。 洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA 不能全部洗脱下 来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的 DNA 浓度会降低，但DNA 总量不会减少。 洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5 分钟，可提高洗脱效率,加大DNA 产量。 二、提取的基因组DNA 有降解，如何解决? 1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存： 陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA 降解，或低温 保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的 材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。 2 ．未能有效抑制内源核酸酶作用： 某些DNase 含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨 过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌 合剂的裂解液。 3 ．操作过于剧烈导致DNA 被机械打断： 预处理的样品加入细胞裂解液后，所有操作应尽量柔和，避免振荡、搅拌 等剧烈机械力对DNA 片段的损伤。 三、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 1．大肠杆菌老化 请涂布平板培养后，重新桃选新菌落进行液体培养。 2 ．质粒拷贝数低 由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的 高拷贝数载体。 3 ．菌体中无质粒 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒 丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次 接种时应接种单菌落。另外，粒查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4 ．碱裂解不充分 使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶 液P1 、P2 和P3 的用量，对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用 溶液P1 、P2 和P3 ，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5 ．溶液使用不当 溶液P2 、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37C 保温片刻直至溶解为 清亮的溶液，才能使用。 6 ．吸附柱过载 不同产品中吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。 若用富集培养基，例如TB 或2*YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常的拷贝 数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB 培养液体积。 7 ．质粒未全部溶解（尤其质粒较大时） 洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8．乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9 ．洗脱液加入位置不正确 洗脱液应中在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到 最大洗脱效率。 10．洗脱液不合适 DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB （10Mm Tris-HCI,1Mm EDTA ,PH8.5 ）或水。洗脱效率还取决于PH 值，最大洗脱效率在pH 7.0-8.5 间。 当用水洗脱时确保其pH 值在此范围内，如果pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱 时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 11．洗脱体积太小 洗脱体积对回收率有一定影响，随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品 浓度降低。为了得到较高的回收