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【精选】大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量
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江苏金丝利药业有限公司
操作规程 题 目 大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程 编 号 QC-OS-026-06 复 印 号 制 定 人 审 核 人 批 准 人 制定日期 审核日期 批准日期 颁发部门 质检部 生效日期 分发部门（岗位）：档案室、生产部、质检部、理化检测2 修订原因及目的：对配液及具体操作进行细化完善。
标题：进一步加强注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量的控制。
范围：注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量的检测。
责任人：质检部经理、理化检测人员
正文：
一 制订依据：《中国药典》2010 年版三部。
简述：利用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量，具体如下：将兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被，结合菌体蛋白，再和有辣根过氧化酶标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体结合，加入底物，产生的物质在492nm处测吸光度，与参考品的标准曲线对照，即可得原液中菌体蛋白的含量。
二 规程：
1 仪器与用具
CS-9301PC型酶标仪 日本岛津制作所。
Multiskan FC酶标仪 美国Thermo Scientific
96孔细胞培养板。
37℃恒温培养箱。
1.5 BCD-180WD型冰箱 上菱冰箱厂。
1.6 移液枪 美国Thermo Scientific。
2 试药与试液
2.1 实验材料 所需化学试剂均应为分析纯。
2.2 包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠0.32g，碳酸氢钠
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操作规程 0.586g，置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。4℃冷藏保存。
2.3 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g（相当于Na2HPO4·12H2O 3.63g，Na2HPO4·12H2O中磷酸氢二钠所占百分比为39.7%）、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解稀释至500ml，121℃灭菌15分钟。
2.4 洗涤液（pH7.4） 取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500 ml，4℃冰箱保存。
2.5 稀释液（pH7.4） 称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml，4℃冰箱保存。
2.6 浓稀释液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml，4℃冰箱保存。
2.7 底物缓冲液（pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷酸氢二钠
（Na2HPO4·12H2O）1.84g，枸橼酸0.51g，加水溶解并稀释至100ml，4℃冰箱保存。
2.8 底物液 取邻苯二胺8mg，加30%过氧化氢30μl，溶于底物缓冲液20ml中，临用时现配。
2.9 终止液 1mol/L硫酸溶液，取硫酸5.5ml，缓缓注入80ml水中，冷却至室温，加水稀释至100ml，摇匀；硫酸的用量根据硫酸的实际含量计算得出，计算公式如下：
硫酸用量=（摩尔浓度×配制体积×摩尔质量）/（含量×密度）。
2.10 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体（DakoCytomation，Polyclonal Rabbit Anti-Escherichia Coli，Code No./Code-Nr. B 0357，规格：9.9g/L）。于2~8℃冰箱保存，有效期按标签规定执行。每次实验前取4μl，在刻度试管中用包被液稀释至4ml（稀释1000倍），制成10μg/ml抗体。
2.11 辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体（E.coli Antibody，HRP comjugate，Thermo scientific，Catalog Number：PA 1-73030，规格：1ml）。于2~8℃冰箱保存，有效期为6个月，-20℃保存，有效期更长。每次实验前取4μl，在刻度试管中用稀释液稀释至4ml（稀释1000倍）。
2.12 标准品溶液的制备 标准品规格为204 μg/支，4℃保存，由中国药品生物制品检定所提供。标准品用1ml纯化水溶解，再用稀释液定容至10ml，分装至0.5 ml EP中，装量为0.15ml/管，4℃保存，有效期为一周；-20℃保存，有效期为6个月。在配制记录中明确其配制批号，其格 编号：QC-OS-026-06 页号：3/4
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