重组质粒pIRES-CD构建及其对腺样囊性癌细胞杀伤作用的初步实验研究.pdfVIP

山东大学硕士论文 诱导肿瘤细胞的凋亡。‘“”。在以往的研究中单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／无环鸟 血脑屏障而在CNS应用受到一定的限制。而cD基因是另外一种自杀基因，哺乳动物细 胞不含该酶，细菌和真菌能产生该酶，可将5一FC脱氨为5一FU。临床上5一Fc和5一FU 的药代动力学非常清楚，与5一Fu不同，5一FC治疗剂量对人体毒副作用不大，口服容 易通过血脑屏障，这是CD／5一FC系统在治疗口腔颌面部肿瘤实验研究中，比HSv—tk ／GCV系统应用广泛的原因。 本实验正是基于此，旨在构建真核表达质粒pIREs—cD，并将其转染ACC一2细胞后， 应，以寻求有效的自杀基因治疗方法。 方法 首先根据CD的DNA序列设计、合成引物，并将扩增后产物插入克隆载体 pIRES—CD，进行菌落PcR初步鉴定及重组质粒的酶切分析。然后以电穿孔方法将重组 表达质粒pIREs—cD转染Acc一2细胞，新霉素(GeneticinG418)筛选后获得稳定表达 加入不同浓度的5一Fc对Acc一2／cD细胞和ACc一2细胞进行处理，并以未加药组作对照， MTT法检测药物的杀伤效果及其对Acc一2细胞体外生长增殖的影响，计算细胞生长抑制 应用不同浓度5一FC对腺样囊性癌的杀伤作用及旁观者效应。 结果成功克隆了大肠杆菌cD基因，并进行了DNA序列分析，和基因库报道的基 因序列基本一致，然后将克隆的cD基因插入到克隆载体pMDl8一T，后将重组的克隆载 的基因已整合到ACC一2细胞染色体DNA链中并转录表达，目的基因转染对ACC一2细胞的 形态及生长特性影响不大。 4 山东大学硕上论文 不同混育比例的细胞杀伤作用结果显示，转染细胞对5．Fc的敏感性与混育比例的 大小有关。随着AcC一2／CD细胞比例的增大，其杀伤作用越明显；当混合细胞中转染 细胞比例为5％时即出现旁观者效应，当混育比例超过5096后各组的细胞杀伤效果已无 显著差异(P0．05) 基因进行序列分析显示，克隆的序列和文献报道的基本一致。 进行了菌落分析和酶切鉴定。 得了预期的228bp的片段。 4．应用5-FC对ACC．2／CD细胞具有剂量依赖性生长抑制作用，且随着剂量的增 加，对细胞的杀伤作用增强；且5．FC肥D体系可引起较明显的旁观者效应。 关键词：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因；基因克隆；载体；腺样囊性癌；5一氟胞嘧 啶；基因治疗 5 山东大学硕士论文 ANEXPERIMENTALSTUDYoNTHE OF oFADENoID ANDTHESUICIDEGENETHERAPY pIRES．CD CYSTICCARCINoMA OfalAndMaxillofacial Special时 Su玛ery CandidateHuangShengyun SupeⅣisorZhangDongsheng ABSTRACT Adenoid isalsocalled carcinoma，which 0bjenive cystic thatitcomesfrom BilIroth．M0st耐lol缸considercd duds，Or feportedby