木瓜蛋白酶的活力检测标准研究.doc

木瓜蛋白酶的活力检测标准研究 张兴灿，陈朝银*，李汝荣 （昆明理工大学-清华大学生物资源开发研究所 ，云南昆明 650224） 摘 要：分 别 按 国 家 标 准 和 企 业 标 准 中 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 了 两 个 酶 制 剂 企 业 生 产 的 木 瓜 蛋 白 酶 酶 活 力 ，结 果 表 明 ， 企 业 标 准 与 国 家 标 准 测 定 的 酶 活 力 两 种 方 法 测 定 的 结 果 差 别 高 达 几 十 倍 ，原 因 可 能 与 底 物 溶 液 的pH、反 应 条 件 和 巯 基 还 原 剂 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 有 关 。 关键词：木 瓜 蛋 白 酶 ，酶 活 测 定 ，标 准 Study on determination standards of papain activity ZHANG Xing-can, CHEN Chao-yin*, LI Ru-rong （Institute of Bioresource RD of Kunming University of Science and Technology-Tsinghua University, Kunming 650224, China） Abstract：The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended on National standards and Enterprise standards was studied respectively，found that the results had great differences. Then possible reasons were analyzed，the main influential factors may be pH of substrate，reaction conditions and cysteine hydrochloride. Key words：papain；determination of enzyme activity；standard 中图分类号：TS207.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2011）10-0435-03 木瓜蛋白酶（Papain，EC是一种具有 广泛底物专一性的含巯基蛋白酶，有很强的分解蛋 白质的能力，此外也具有水解酰胺键和酯键的特性[1]。 由于它具有适用pH范围广、热稳定性好等优点，广泛 应用于医药、食品、纺织、制革、饲料、染料等工业生 产中。活力是蛋白酶最重要的质量指标，目前国家仅 有蛋白酶制剂的通用标准[2]，由于对各类蛋白酶制剂 尚无标准规定，企业、生产厂商通常根据国家蛋白酶 制剂通用标准制定自己公司特定蛋白酶的企业标 准。例如，目前我国的一些植物蛋白酶制剂工厂已在 生产木瓜蛋白酶，但对于木瓜蛋白酶的质量检测，特 别是酶活性检测的方法、条件和标准比较混乱，使产 品保存和销售受到严重影响[3]。为了提高产品质量， 增强国际市场的竞争能力，亟待加强管理和统一检 测标准。经我们研究发现，企业标准与国家标准测定 的酶活力的差值竟然高达几十倍，这说明我国的酶 制剂市场存在着较大的漏洞。 释放出的三氯乙酸可溶物在280nm处的消光值相当 于浓度为1μg/mL酪氨酸消光时所需的酶量，为一个 酶活力单位（U）。 Ultrospec2100 型 紫 外 分 光 光 度 计 Amersham Pharmacia公司；HH-S型恒温水浴锅 郑州长城科工 贸有限公司；实验所用试剂 均为分析纯。 1.2 国标GB/T 23527-2009规定的方法[4] 1.2.1 试剂与溶液 1.2.1.1 三氯乙酸 称取三氯乙酸65.4g/L，用水溶解 并定容至1000mL。 1.2.1.2 缓冲溶液 因为木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，采 用磷酸缓冲液（pH=7.5），分别称取磷酸氢二钠（Na2HPO·4 12H O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH PO·2H O）0.5g，加水 2 2 4 2 溶解并定容至1000mL。 1.2.1.3 L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称 取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸（0.1000±0.0002）g， 用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为 1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐 酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸 标准储备溶液。 1.2.1.4 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠片剂 20.