质粒DNA纯度的测定及其构型观察.pptVIP

实验二 质粒DNA纯度的测定及其构型观察 ——琼脂糖凝胶电泳法 实验目的 进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染（DNA的纯度）； 观察质粒DNA三种基本构象； 可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度。 实验原理 荧光物质Goldview在紫外光照射下能发出荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的Goldview就插入DNA分子中形成荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍。 荧光的强度正比于DNA含量，如将已知的标准样品做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。 电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需5-10ng的DNA，就可从照片上比较鉴别。 实验原理 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样) 。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同、构型不同的DNA分子； 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系。 可以此特征区别染色体DNA、质粒DNA和RNA。 若用小刀取下含质粒DNA的凝胶带经洗脱则可得纯DNA，用单一切点的酶消化后，与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。 实验原理 DNA分子在凝胶中泳动的速度还与DNA分子本身的构型有关： 共价闭合环状DNA（cccDNA）,超螺旋结构泳动最快 两条都断开的线状DNA（LDNA），线性结构泳动速度居中； 一条链断开的开环DNA（ocDNA）,复制中间体泳动最慢。 因而可以通过电泳来区别质粒DNA的构型。 实验方法 选择适当大小的电泳槽和点样梳，点样梳底部离电泳槽水平面的距离为1-2mm。 制备琼脂糖凝胶：称取1%浓度的琼脂糖，加入TAE缓冲液，在微波炉上熔解，待凝胶冷却到50℃左右时，加入Goldview混匀后，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。 待凝胶冷却至凝固后，取出点样梳，在电泳槽内加入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面。 在待测样品中加入6×loading buffer，混匀后小心地进行点样。每孔加样量视梳子的大小和胶的厚度而定。 打开电源开关，最高电压不超过5V/cm,即小电泳槽不得超过50V；当琼脂糖浓度低于0.5%时，电泳温度不能太高。 电泳时间随实验具体要求而定，一般待DNA带分开后即可停止，当溴酚蓝泳动至2/3凝胶时可停止电泳，约需1小时左右。 电泳结束后，小心取出凝胶，将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果。 质粒构型观察示意图 实验三 DNA的纯度、浓度的测定 ——紫外分光光度法 实验目的 从以上实验中提取到的质粒DNA，为了要作下一步的PCR或者酶切试验，必须测定DNA的纯度和浓度。 实验原理 核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。 根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.8～2.0时，认为已达到所要求的纯度。 当OD260=1时 dsDNA(dsRNA) = 50μg/ml ssDNA(ssRNA) = 40μg/ml 核苷酸 = 20μg/ml 当RNAOD260/OD280 ≈2.0 纯品 当DNA OD260/OD280 ≈1.8～2.0 纯品 ＞ 2.0 RNA污染 ＜ 1.8 pr污染 实验方法-DNA浓度和纯度鉴定 取石英杯一只，加入去离子水2500μl，放入751型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，在260nm处调零。 将水倒掉，换成2490μl水和10μl DNA溶液的混合液，按照同样的方法测出DNA样品在OD280的值。 按公式算出所制备的DNA浓度及纯度。DNA浓度（μg/ml）=OD260值×稀释倍数×50μg/ml×L ；DNA纯度= OD260/ OD280（要求比值在1.8-2.0范围内） 实验方法-RNA的浓度测定和吸收光谱绘制 RNA的测定 蒸馏水作为空白对照， 在230nm、 240nm 、 250nm 、260nm、 270nm 、 280nm、 290nm波长分别测样品RNA的OD值。 绘制核酸紫外吸收光谱曲线 以波长为横坐标，OD值为纵坐标，绘制核酸的紫外吸收光谱曲线。 计算RNA的浓度