实验十二 谷丙转氨酶活性检测.ppt

血清谷丙转氨酶活性的测定 一、实验目的 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 二、基本原理 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。 * 仪器 1. 5×15cm试管、刻度吸量管。 2. 恒温水浴、离心机、721型分光光度计。 * 试剂 1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液 ⑴0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。 ⑵0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。 三、仪器与试剂 2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL） 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。 3. ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) 取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 4. 2.4二硝基苯肼溶液 取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol /L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。 5. 0.4mol/L NaOH溶液 常规配制。 1、血清样品制备 取鸡血100mL于4oC静置10hr，后经离心分离得到血清， 保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中 高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适 当稀释后再用) 。 2、标准曲线制作 取6支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。 以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标 纸上绘制标准曲线。 四、实验操作 3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定 取4支干燥洁净试管，按下表操作（血清和底物溶液 事先保温10min）： 五、实验结果 1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性 2、计算： 丙酮酸物质的量（μmol） SGPT活性单位/100mL= ×1000 时间（min） 1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过 500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无 作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸 价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高， 会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。 六、注意事项 6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。 7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。 8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管 9. 操作中加 0.4N NaOH液时，需以较慢速度加入，并且边加边摇匀加快时则a一戊酮二酸引起的发色增强。 10. 本实验中各试剂加量都需要准确，并且要注意控制条件，保温时间要严格. 11.本法测定SGTP正常值为40单位以下。 * 1个卡门氏单位的定义是