[医学保健]基因的分离与鉴定.pptVIP

基因的分离与鉴定 5.1 DNA克隆片段的产生与分离 5.2 重组体DNA分子的构建及导入 受体细胞 5.3 基因克隆的实验方案 5.4 克隆基因的分离 5.5 重组体分子的选择和鉴定 基因的克隆包含着待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容 在真核生物中,单个基因仅占整个基因组的极其微小的比例。必须经过扩增(amplification)才有可能分离到含有目的基因的DNA片段。因此需要先构建基因文库(gene library)或叫DNA文库(DNA library)。 DNA文库:来源于染色体DNA基因组,是来自单个基 因组的DNA克隆片段汇总,包含基因组中 所有DNA序列。 cDNA文库:来源于基因组DNA的转录本(mRNA)再 反转录成的cDNA拷贝,是单个基因组编 码序列的cDNA克隆片段汇总,包含基因 组中所有编码序列。 应用大肠杆菌 作寄主进行外源 DNA片段克隆的 综合实验方案 5.1 DNA克隆片段的产生与分离 5.1.1 基因组DNA的片段化 (1)利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题 获得外源DNA片段最简单的方法是鸟枪法(shotgun approach):利用限制酶消化给体基因组DNA,不经过凝胶电泳分布分离,就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。此种方法的缺点是:载体上插入的外源片段大小不同,克隆群体庞大,不利于选择带有目的基因的克隆 ;当目的基因的核苷酸序列中有一个或数个限制酶识别位点时,需要好几个克隆才有可能获得目的基因的全序列。目的基因核苷酸序列越长,需要的克隆就越多;限制片段太大或太小都不利于正常基因文库的构建。 解决这些问题的方法有:限制酶局部消化;机械切割法等 限制酶酶切片段的随机程度和大小与其识别序列长短有关: 4bp:44=256bp; 6bp:46=4096bp; 8bp:48=65536 随机程度高 随机程度低 (2)基因组DNA的双酶消化策略 1978年,有学者提出了利用两种限制酶混合消化基因组DNA的实验策略。应用这种方法可以获得适于克隆的随机片段化的DNA群体。 在进行局部的双酶消化后,可产生大部分为10~30kb范围的随机片段,它们之间存在着有效的随机的序列重叠现象。然后通过蔗糖密度梯度离心等方法得到20kb左右的随机的DNA片段群体,适于λ噬菌体载体的克隆能力。这样,经体外重组、包装和转化后,有把握获得足够多的重组体转化子克隆,构建成几乎完美、代表性的基因文库。 在双酶消化策略中,可根据情况选择限制酶组合或具有同尾酶特点的单酶切──在克隆组合。 5.1.2 DNA片段的大小分布 构建完整的基因文库(DNA文库)时,并不需要对某种基因或DNA片段作特别的富集处理。但如果要克隆特定大小的含有目的基因的DNA片段时,可在克隆之前先对片段化的给体DNA群体进行按大小的分步分离,则可以显著提高克隆基因的分离频率。 5.1.3 编码目的基因的克隆片段的富集 如果克隆的目的是分离特定的基因,在对该基因的信息有所了解的情况下,可以通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心等方法进行富集。但是,被克隆的目的基因的全序列应该在一条DNA片段上,所以,随机片段化的DNA不适于用此方法。 举例:Qβ蛋白质(光合作用相关蛋白质)的psbA基因的克隆 将纯化的水稻叶绿体DNA(ctDNA)分别用BamHI、EcoRI及HindIII等限制酶局部消化,然后用含有溴化乙锭的1﹪琼脂糖凝胶电泳作分步分离; 进行Southern印记转移,同32P放射性标记的目的基因探针进行杂交,结果表明,2.2kb的EcoRI片段、3.8kb的BamHI片段等含有psbA基因的编码序列; 根据这些结果,将对叶绿体DNA进行再一次的电泳分步分离,把2.2～2.5kb范围的EcoRI片段(含有psbA基因的