第一章植物组织培养实验室2.ppt

一、外植体的培养条件 1、光照 光照对植物生长发育有重要作用，是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时，也可每天光照16小时，8小时黑暗。 2、温度 离体培养中对温度的控制比光照更为重要，大所数植物最适温度在23-32℃之间。培养室温度是25±2℃。低于15℃时，培养的组织生长停顿，高于35℃对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备。 3、湿度 培养瓶内相对湿度通常是100%，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。 4、氧气 离体培养的试管苗是需要氧气的，在固体培养或液体静置培养时，如果组织完全浸入培养基中，与氧气隔绝，就会停止生长。因此，接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。 组织培养步骤图 （1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。 （2）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。 将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。 （二）培养基制作程序 1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。 2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。 3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。 4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。 5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。 6、蒸馏水定容至所需体积。 7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0)，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。 8、迅速分装到培养瓶中，备用。 培养基制作程序图 培养基是离体培养物赖以生存和生长的人工环境的重要组成部分，常用的培养基依据其物理状态的不同分为固态培养基和液态培养基。 固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。 液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用脱脂棉等。 固体培养基 三、培养基及培养器械的灭菌 制备好的培养基如果带菌，会导致植物离体培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。 （一）高压蒸汽灭菌 培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法： 1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。 2、灭菌锅加水至淹没电热丝。 3、封闭高压灭菌锅各出气口。 4、接通电源加压至49kPa（0.05MPa） 5、打开排气阀，排冷气至压力0 kPa。 6、继续加压至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃） 7、压力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）时，稳压在此压力15-20min。 8、关闭电源自然冷却至压力为0 kPa。 9、取出培养基和器械冷却，贮存于30℃以下室内。 （二）干热灭菌 培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械，可以进行干热灭菌。 即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下灭菌2小时。 灭菌完毕冷却后取出器械贮存。 贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。 灭菌后的培养基一般应在2周内使用，时间过长易造成潜在的污染。 培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象，该培养基不能继续使用，应查明原因重新配制。 第四节? 外植体无菌接种 一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。 一、植物材料的培养与取材 外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。 1、外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 -无菌环境下已经过离体培