王镜岩 生物化学 经典课件 18基因工程 考研必备 学生物化学必备.ppt

* * * * * * * * * * * * (三) 克隆基因的分离与鉴定 用克隆杂交对基因组文库进行筛选 用已知氨基酸序列设计的寡核苷酸探针筛选文库克隆基因 差别杂交：若A组细胞用生长因子处理，B组细胞不作处理，将其中的一组mRNA逆转录成cDNA文库，与另一组的mRNA杂交，或将两组的mRNA均逆转录成cDNA再进行分子杂交，不能形成杂交双链的是二者差异表达的基因。 扣除杂交：比差别杂交省时、省力、灵敏度高，基本原理如图所示。 用Southern杂交法鉴定克隆基因 (四) 聚合酶链式反应扩增基因 （五）筛选目的基因的其他方法 1.蛋白质组学：通过双向电泳，聚焦层析-电泳等方法对比相关样本，确定目标蛋白，经测序用遗传密码推测基因的部分序列，用PCR等方法获取目的基因； 2.基因芯片：分析相关样本的mRNA，确定目标基因； 3.mRNA差异显示：提取欲对比的两个样本的mRNA，分别用5′T11-MN或5′-T12MN(M代表除T以外的任意核苷酸，N代表任意核苷酸)共12种不同的下游引物合成cDNA的第一链，所得24种cDNA的第一链均用通用引物合成第二链，并引入放射性同位素标记，将相对应的12对cDNA分别用测序胶电泳分离，放射自显影，对比二者的条带，找出差异，回收特异性差别条带，扩增，测序，或合成探针筛选基因。 4.表达序列库：将基因克隆到表达载体，表达后用免疫学方法、产物功能测定、产物的结构研究等方法鉴定特定的基因。 5.基因定位诱变 6.筛选的目的基因通常要进行序列测定 三、克隆基因的表达 (一) 基因表达的控制元件 在典型的表达载体中，真核编码序列被插入启动子和转录起始点的下游，插入位点的下游应当有转录终止信号，转录产生的mRNA应包含核糖体结合位点。 （二）RNA的表达 表达载体携带能够被噬菌体SP6的RNA聚合酶辨认的启动子。 SP6 RNA聚合酶可以在体外高效率地转录,将任何目的DNA插入SP6启动子下游的多接头克隆位点，可以连续的转录产生RNA，转录起始前，环状的表达载体会在插入位点或其附近被单一位点裂解而线性化，因此，转录会在固定的位点终止。 融合lac和trp的启动子，可被IPTG诱导，是最常用的原核启动子。 1.表达非融合蛋白 用原核生物对真核基因进行非融合表达，容易得到较大的表达量，但表达产物不易形成正确的折叠，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含体，裂解包含体时，蛋白质会变性，需要复性，才能得到有活性的蛋白质。 （三）蛋白质的表达 2.表达融合蛋白 融合蛋白的N末端由原核DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码，含原核细胞多肽的融合蛋白可避免细菌蛋白酶的破坏。表达融合型蛋白时，为了得到正确的真核蛋白，在插入真核基因时，其阅读框架与融合的DNA片段的阅读框架要一致，翻译时，才不至于产生移码突变。 3.表达分泌蛋白 表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施。在原核表达系统中，人们研究比较多的主要是大肠杆菌。 大肠杆菌主要由四部分组成：胞质、内膜、外膜及内外膜之间的周间质。一般情况下，所谓 “分泌”是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一过程。而蛋白质从胞质跨过内、外膜进入培养液的情况较为少见，被称为“外排”以区别于“分泌”。 工程菌必须在有足够量的繁殖以后，再表达目的基因，否则，没有足够的菌量，就得不到足够的表达产物。通常在细菌达到对数生长期后，再加入诱导物，诱导目的基因的表达，X-gal是常有的诱导物。 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 典型的穿梭质粒，分别含有酵母和细菌的起始位点。 4.外源基因在酵母中的克隆和表达 在酵母中表达真核基因，表达产物容易形成正确的折叠和糖基化，但不容易形成较大的表达量。通常将目的基因插入穿梭载体，在大肠杆菌中扩增后，再转入酵母菌进行表达。用酵母菌表达的不少蛋白质已经作为基因工程产品，产生了很好的经济效益和社会效益。 整合载体（yeast integrating plasmid)无酵母的复制起点，必须整合到染色体中才能稳定存在。 附加体质粒（yeast episomal plasmid)有酵母的复制起点，在酵母细胞中以高拷贝存在。 复制质粒（yeast replicating plasmid)有酵母的自主复制序列（autonomous replicating sequence,ARS)，在酵母细胞中以中等拷贝存在。 含着丝粒（CEN)的质粒（yeast centromere- containing plasmid)含有ARS和CEN，在酵母细胞中以单拷