黏质沙雷氏菌产几丁质酶二步发酵工艺的优化.pdfVIP

第 32卷 第 1期 华 侨 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) VoI．32 NO．1 2011年 1月 JournalofHuaqiaoUniversity(NaturalScience) Jan．2011 文章编号 ： 1000—5013(2011)O10067—05 黏质沙雷氏菌产几丁质酶二步发酵工艺的优化 施腾鑫 ，贺淹才，刘嘉，舒静波，周娟 (华侨大学 工业生物技术研究所，福建 泉州 362021) 摘要： 采用二步发酵法，研究黏质沙雷氏菌的产几丁质酶发酵条件 ．在二步发酵产酶的过程中，通过单因素 法优化得到二步发酵培养基中最适碳源、氮源的质量分数和菌龄，同时选取发酵时间、初始 pH值 、接种菌体 量和装液量 4个因子进行正交试验．最终得到的最优条件：胶体几丁质质量分数为 0．8 ，酵母粉质量分数为 1．0 ，菌龄为 12h，发酵时间为72h，初始pH值为8．5，菌体干质量为 90mg，装液量为 2OmL．在此条件下， 酶活力可达 l7．020“kat·I ．另外 ，在二步发酵工艺中添加 0．1 纤维素，酶活力可提高至 18．804#kat· I ，比一步发酵提高 1．27倍． 关键词： 黏质沙雷氏菌；几丁质酶；二步发酵；一步发酵；优化 中图分类号： Q814．1；TQ920．6 文献标识码： A 几丁质酶(Chitinase，EC3．2．1．14)是一种可催化水解几丁质的诱导酶_1】．其来源广泛，应用前景广 阔，在农业、环保、食品、化妆品和生物技术等领域均有涉及_2。j．但是，由于所选菌株产酶能力低 ，几丁 质酶和几丁寡糖的工业化生产及广泛应用受到制约 ．由于构建几丁质酶基因工程高产菌技术至今 尚未 取得突破性进展 引【，因此，寻找合适的发酵工艺条件，仍然是提高微生物菌株产酶水平的重要手段之 一 [9] ． 传统的一步发酵法是将活化的种子液接人培养基中诱导产酶，进而对产酶的一系列条件进行优 化ELO-13]．但该方法的产酶效率有限．二步发酵是将菌体生长阶段和诱导产酶阶段分开，从而降低产物 对产酶的抑制作度用并提高菌体浓度__】，提高产酶效果．本文从减少反馈抑制的思路出发，利用单因 素考察和正交设计法 ，对一株黏质沙雷氏菌的二步发酵产酶工艺条件进行优化． 1 材料与方法 1．1 供试菌株 黏质沙雷氏菌 (SerratiamarcescensATCC14O41)，购于中科院微生物研究所． 1．2 试剂及仪器 几丁质(美 国Sigma公司)，蛋 白胨、酵母粉 (英 国Oxoid公司)；羧 甲基纤维素(CMC，中国医药集 团)，其他试剂均为分析纯．HYG一Ⅱ型恒温调速摇瓶柜 (上海欣蕊 自动化设备有限公司)，MicromaxRF 小型冷冻离心机(美国Thermo公司)，4K15大型冷冻离心机(美国Sigma公司)． 1．3 培养基 LB培养基 (质量分数)：l 蛋白胨，0．5 酵母粉，1％NaC1，pH值 自然；已优化的一步发酵培养基 (质量分数)：0．5 胶体几丁质，1．2 酵母粉 ，0．025 MgSO ·7H O，0．095 K HP04，0．03 KH2PO4，0．001 FeSO4·7H2O，pH值为 7．0～7．2． 1．4 几丁质酶活力测定 参照Nawani法_15]，把 0．5mL胶体几丁质与适当稀释的0．5mL酶液置于 5O℃水浴中反应 1h， 用DNS法_1]测定．酶活力单位(kat)定义：在 50。C下，每分钟释放 出相当于 1一ffmol的N一乙酰葡萄糖 收稿 日期： 2009—12—27 通信作者： 贺淹才 (1949一)，男 ，教授，主要从事生物化学与分子生物学的研究．E-mail：yche@hqu．edu．Cn． 基金项 目： 福建省 自然科学基金资助项 目( 华 侨 大 学 学 报 (自然 科 学 版) 胺 (NAG)所需要的酶量． 1．5 二步发酵法 将活化的黏质沙雷氏菌液体种子接种到IB培养基，菌体细胞扩增培养 12h后，于4℃，10000r· rain 离心 15min，弃上清 ．将菌体沉淀用生理盐水(0．9 的NaC1溶液)洗涤两次后，接种到产酶培养 基中，于 30。C，