磁珠法与碱裂解法在质粒DNA提取上的对比磁珠法与碱裂解法在质粒DNA提取上的对比.pdfVIP

河南生物工程重点实验室 E-mail:zjd6650@ 磁珠法与碱裂解法在质粒DNA 的提取上的对比 摘要 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1-200kb 不等，为双链、闭环的DNA 分 子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。本 实验采用磁珠法和碱裂解法小量制备质粒DNA，并对比其操作及结果。实验结果：一般 (OD260-OD320)/(OD280-OD320)在 1.7-2.0 左右，(OD260-OD320)/(OD230-OD320)在2 以上， 电泳条带清晰，无拖尾现象，点样孔无滞留，说明纯度较高。 关键词：质粒，磁珠法，碱裂解法 河南生物工程重点实验室 E-mail:zjd6650@ 目录 摘要 1 目录 2 文献参考 3 实验内容与方法 4 实验结果及结论 6 参考文献 7 致谢 8 河南生物工程重点实验室 E-mail:zjd6650@ 文献参考 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1-200kb 不等，为双链、闭环的DNA 分 子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质 粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而 宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的 抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒) 、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子) 等都是常见的天然质粒。 分离质粒DNA 的方法是依据其与染色体DNA 分子大小不同、碱基组成的差异以及质 粒DNA 的超螺旋共价闭环状结构的特点来进行。目前常用的提取质粒的方法有碱裂解法、 煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法。其原理是将细菌菌膜破裂后，利用质粒 DNA 与染色体DNA 之间变性与复性的差异而达到分离的目的，因为①染色体DNA 分子量 比质粒DNA 大得多；②从细胞中提取到的染色体DNA 大多断裂成线状分子，而质粒DNA 则为共价闭合环状结构。在pH 高达 12.6 的条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构 解开变性，同时由于受到机械切力或核酸酶等的作用，染色体DNA 易被切成大小不同的片 段；而闭环质粒DNA 链氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分 离，不易发生变性。当以pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液调节pH 至中性时，质粒DNA 又恢复 其天然构象，以可溶状态存在于液相中，而染色体DNA 不能复性而形成缠连的不溶性网状 结构，与不稳定的大分子RNA、变性的蛋白质-SDS 复合物以及细菌碎片等一起沉淀而被除 去。再进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，然后用无水乙醇沉淀质粒DNA，可 得到纯化的质粒DMA。 生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性 物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移 动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离 变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。 传统方法： 1.碱裂解法：碱裂解法是基于DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。 2.煮沸法：煮沸时将样品中的DNA 通过核酸裂解液的作用释放出来，离心沉淀后将杂 质去除，上清液即可用作PCR 扩增。 3.浓盐法：利用RNA 和DNA 在电解溶液中溶解度不同，将二者分