SMARTer技术.pptVIP

： ：800-810-6261；010/ 86 ： service@ 我们将竭诚为您服务！ 技 术 服 务 Thank You ！ * * * * * ? SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍 ? * * ? ? SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍 ? * * ? ? SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍 ? * * ? Title of the Presentation can go here * SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍 宝日医生物技术（北京）有限公司 主 要 内 容 1 SMARTerTM VS 传统cDNA合成技术 2 SMARTerTM 技术概要 3 Clontech相关产品 1 SMARTerTM VS 传统cDNA合成技术 DNA pol extends 3’ ends, displacing next RNA piece AAAAA 5’ 3’ (start) (stop) mRNA transcript (poly A+ RNA) AAAAA 5’ 3’ TTTTT TTTTT AAAAA AAAAA TTTTT 3’ 5’ AAAAA TTTTT oligo primer 5’ 3’ Prime mRNA with oligo primer RT extends primer RNase H DNA pol DNA Ligase Second Strand Enzyme Cocktail RNase H creates nicks in RNA Ligase ligates segments “Gubler and Hoffman procedure” (Gubler, U. Hoffman, B. J. (1983) Gene 25:263 - 269) 传统cDNA合成技术 SMARTTM 技术 SMART Template RNA Switching Mechanism At the end of 末端转移酶活性 自动转换模板功能 什么是SMARTerTM 技术? SMARTerTM技术原理图 5’ Poly A 3’ Poly A+ RNA 修饰的 Oligo (dT) 引物 XXXXX 逆转录酶到达mRNA模板末端时，自动在新合成的全长cDNA 的末端添加几个dX。 第一链cDNA合成及dX加尾 5’ Poly A 3’ 模板转换和RT延伸 5’ Poly A 3’ SMARTer Oligo 或 SMART T7 Oligo XXXXX SMARTer Oligo 与dX互补，cDNA以SMARTer Oligo为模板继续延伸。 获得带有接头序列的第一链cDNA 第一链cDNA 一步反应 第一链cDNA 各 种 应 用 RACE PCR, qPCR 文库构建 消减杂交 新一代测序 探针制备 正义RNA扩增 LD-PCR扩增 ds cDNA SMART技术的特点 SMARTerTM技术特点 只需纳克级总RNA就可以合成高质量的双链cDNA 保持原有相对丰度的基础上扩增mRNA 通过 LD-PCR扩增cDNA 单酶反应，一管操作 2 SMARTerTM 技术概要 SMARTerTM 技术概要 图1. SMARTScribeTM RT 获得更长的第一链cDNA 。 polyA+ RNA 为模板。 SMARTScribeTM RT—合成更长的第一链cDNA SMARTScribeTM RT—获得14.6 kb以上的cDNA片段 图 2. 利用SMARTScribe RT 和合成的RNA 为模板进行RT-PCR分析。 合成的RNA模板进行一系列的梯度稀释后，样品中含有105 -10RNA的拷贝。在的RNA模板中添加 50 ng 的HeLa 细胞总RNA，以增加模板的复杂度。使用Advantage? 2 DNA Polymerase Mix合成第二链 。36个循环后获得350bp片段。 SMARTScribeTM RT—灵敏度高 Lane M: 100bp DNA size marker. SMARTScribe RT可以从低至10个RNA拷贝中合成第一链cDNA。 图 3. Human Universal Total RNA 梯度稀释后采用SMARTScribe RT及P 、Q公司的逆转来酶进行反转录 。取1μl 的RT产物用于 PCR 扩增beta-actin 5’端的300bp片段。 SMARTScribe Competitor P Competitor Q 1 ug 100 ng 10 ng 1 ng 100 pg 10 pg 1 pg 0.1 pg SMARTScribeTM