ELISA的原理及分类.ppt

ELISA的原理及分类 50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。 由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。 现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 ELISA的基本原理 酶联免疫吸附试验 （Enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA） 概念：以酶作为标记指示物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。 三个方面：固相支持物 包被的抗原或抗体 酶标记的抗体或抗原和酶反应底物 1. 抗原(antigen，Ag) 一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能： ①免疫原性(immunogenicity):诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen)； ②免疫反应性(immunoreactivity):抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。 2. 抗原的基本理化特性 —— ?大于Ab或者TCR的抗原结合部位 ?无机物不能成为抗原； ?分子量太小（如对氨基苯甲酸，DNP）的有机物不能成为抗原； ?蛋白质是最主要、最常见的抗原； ?多糖、脂肪、核苷酸等有机大分子能被B细胞和 gd-T 细胞所识别。 3. 最大特性：免疫应答的特异性 某一特定抗原只能刺激机体产生针对该特定抗原的细胞和体液免疫应答；某一特定抗原只能与其相应的特异抗体或致敏淋巴细胞产生结合反应。 4.抗原抗体的结合:实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。抗体分子N端可变区形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒表面抗原成分的抗体，HBeAg和HBcAg也可诱导机体产生相应的抗体，虽然这两种也来源于同一病毒，但表面抗原仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 但是这种特异性也不是绝对的。 交叉反应(cross reaction) 当两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应，从而在抗原抗体反应中可出现交叉反应。 例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。 抗原分类 1.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法 纯化抗原：如HBsAg 从体液，组织或病原体培养物等中采用物理化学方法：超速离心，过滤层析，电泳分离等分离获得。 注：纯化抗原的纯度对相应的免疫测定方法的特异性有较大的影响 合成抗原（多肽片段） 如HCV 缺乏完整的立体构型决定簇，导致抗体的漏检。 基因工程抗原 HBcAg, HBeAg 和HCV 早期： 多为病原体的部分抗原，导致敏感性上缺陷。 融合蛋白：对抗原的生物学和免疫学特性能最大程度的保留，工业化大量 生产，没有提纯抗原存在的传染危险性。 2.干扰免疫测定的抗原 多为机体内源性抗原 异嗜性抗原：不同种属的动物/植物和微生物细胞表面上的共同抗原，广泛的交叉性，故影响免疫测定的特异性。 免疫球蛋白：免疫应答的产物?抗体 最常见的类风湿因子（RF），可于变性的IgG发生特异的结合，在ELISA引起非特异性反应。 抗体—分类 在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内含量低、半衰期短、出现早、消失快、组织穿透力弱，故其保护作用实际上常不如I