PCR技术原理简介2013.pptVIP

* * * * * 2013/3/21 PCR是由美国科学家Kary B. Mullis 提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，获得1993年诺贝尔化学奖。 目录 基本原理 1 2 PCR反应体系 3 PCR的应用 4 实验流程 基本原理 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ，PCR ）：简称PCR技术，是一种体外扩增特异性DNA片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板大量扩增。 一、基本原理 变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离成单链DNA 模板 模板 基本原理 退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少 Primer 1 Primer 2 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 基本原理 延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸底物及Mg2+存在的条件下，5’ 3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 Primer 1 Primer 2 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA Polymerase 基本原理 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 基本原理 1个 PCR 循环完成后得到2个拷贝的靶序列 基本原理 n次循环后靶序列扩增的数量为2n 循环次数 DNA扩增数 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 …… …… 30 230 n 2n 基本原理 二、PCR反应体系 PCR反应五要素： 特异性寡核苷酸引物（Primer） 耐热DNA聚合酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNA模板（Template） 反应缓冲液（Reaction buffer） 反应体系 （一）寡核苷酸引物 引物是PCR特异性反应的关键； PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 反应体系 引物设计的原则： 1. 引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2. 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 3. 引物长度一般为 15-30bp左右。引物的有效长度不能大于 38 ，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物过短也会使特异性降低。 反应体系 引物设计的原则： 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于有效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计Tm值。 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其是3’端不应超过3个连续的G或C。 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折叠成发夹结构影响引物本身复性。 反应体系 引物设计的原则：8. 引物之间不能有连续4个碱基互补，避免两条引 物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物 二聚体，产生非特异性的扩增条带。9. 引物的延伸从3’端开始，3’端不可修饰，而  引物5’端可以修饰，如加酶切位点、标记生物  素、引入突变位点等。10.引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及 倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导  致PCR失败。切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 反应体系 反应体系 引物量： PCR反应中引物的浓度一般为0.2 ~ 1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 （二）耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌yT1株分离提取的，Taq DNA聚合酶它的最适反应温度在75℃左右，在95℃的高温具有良好的热稳定性。 在100ul PCR反应体系中。一般约需加