新兽药特殊毒性试验技术要求.doc

新兽药特殊毒性试验技术要求 ? 限于国内现有条件，经研究确定新兽药特殊毒性试验（“三致试验”）一般只进行致突变试验和致畸试验。在致突发试验中，考虑到检测终点应有原核细胞和真核细胞，基因突变和染色体畸变，体内和体外试验系统，体细胞和生殖细胞之分，确定Ames试验和微核试验为必做试验。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者可以任选一项，若前二者任一项为阳性均必做显性致死试验。这样，在致突变试验中必须至少做三项试验。在致畸试验中，对一般兽药来说，传统致畸试验为必做试验；对饲料药物添加剂还应增加养致畸试验，喂养繁殖毒性试验。喂养繁殖毒性试验一般只做一代繁殖毒性，一代为阳性时应再做第二代繁殖毒性，即： 各项试验方法如后： 一、艾母氏（Ames）试验方法 1、菌种 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准株。 2、菌种鉴定 以上菌种需分别作抗氨苄、抗四环素、抗紫外、结晶紫、组氨酸需求、自发回变数的鉴定。 3、剂量分组 每次试验要求4～5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。液态受检物的剂量从0.05～50μl/皿之间选择，固态受检物从0.1～1000.0μg/皿之间选择，最高剂量可达5000.0μg/皿。选定后的剂量应配制成适当浓度，使每皿加入受检物的体积为100μl或200μl。 4、溶剂 一般以水为溶剂，选用其他溶剂需说明理由。 5、对照物 每次检测要求同时作阳性和阴性对照；用已知的阳性物作阳性对照，用溶剂作阴性对照。加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿。 6、S9制备 选体重200克左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱导后宰杀，处死前12小时禁食。在低温条件下，无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或-80℃冰箱中。制得的S9需作S9活力测定。 7、试验步骤 将经鉴定合格的TA97a、TA98、TA100和TA102菌株分别接种于增菌培养液中。37℃水浴振荡培养，每毫升活菌数不得少于1～2×109。 受检物，包括对照物，按设计剂量配制。取受检物0.1～0.2ml，菌液0.1ml，S9混合液0.5ml或磷酸缓冲液0.5ml，依次加入无菌小试管中，37℃水浴振荡培养20分钟后（也可采用平板掺入法），加入45℃顶层培养基2.0ml，混匀倒入含底层培养基的平皿上，37℃培养48小时。 8、结果评价 在计数菌落前应先观察背景菌苔的生长情况，正常的背景菌苔应呈均匀的砂粒状。受试组与阴性对照组的背景菌苔应一致，阴性对照组的自发回数应在正常值之内。 受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂量反应关系和重现性，判为诱变阳性。 二、微核试验 1、动物 选择成年健康小鼠（应注明品系），将小鼠随机分为受试组和对照组。每组动物数不少于10只（雌、雄各半）或至少6只雄性动物。 2、受试物的处理 将受试物溶于适宜的溶剂中，以0.1～0.2ml/10g体重的给药体积配制成适当的浓度。 3、给药方式 原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。给药剂量以LD50为依据，设3个剂量组。高剂量组应出现毒性反应，一般可采用LD50的0.8～0.5；低剂量组的给药量为LD50的0.05～0.10。 每次试验应同时设阴性对照组和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂。 ４、试验操作 一次给药一般在24，48，72小时取样制片。或二次给药，从第二次给药后的6，24小时取样制片。处死小鼠取骨髓，将骨髓洗入离心管中，离心。常规涂片。姬姆萨染色，镜检。 5、镜检 采用双盲法计数分析，每只小鼠在同一张片子上计数1000个嗜多染红细胞，同时计数嗜多染红细胞（PCE）同正染红细胞（NCE）之比。必要时，亦可采用吖啶橙染色，荧光显微镜分析计数。 6、结果评价 将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复试验P0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。 三、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 １、细胞 采用中国仓鼠卵巢细胞系CHO，染色体数目21。或中国仓鼠肺细胞系CHL，染色体数目25。 2、细胞培养 使用MEN-Eagle’s培养基或1640培养基，配制完全培养液，加15％灭活的小牛血清，100IU/ml青霉素，调节PH7.2～7.4。进行常规单层细胞培养。在细胞处于指数生长期时用胰酶-EDTA液处理，并自培养瓶表面将细胞洗脱下来。计数每毫升培养液含有的细胞数。在含有10ml培养液的25cm2的培养瓶中加2～5×105个细胞。在37℃，湿度95%，5%CO2培养箱中培养过夜。 3、试验分组与剂量 试验分3个受试组，另设阴性和阳性对照组。高剂量组以50%细胞生长抑制浓度为准，否则应说明理由。低剂量组接近