微通道芯片电泳检测结核分支杆菌耐药性基因突变研究.pdfVIP

微通道芯片电泳检测结核分支杆菌耐药性基因突变 王吉1 崔振玲2金庆辉1赵建龙1徐元森1 1中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海，200050 2华东师范大学生物系，上海，200062 1．前言 结核病的发病率和病死率在许多国家呈上升趋势，由于有效抗结核药物种类有限，结核 分支杆菌耐药性的存在更增加了结核病治疗的困难。近年来的研究表明，结核分支杆菌耐药 性的产生分别与编码菌株中多种功能蛋白的基因发生突变有关。因此建立快速检测这些基因 突变的方法，对于了解结核病人的耐药情况，以便进行早期、有效的治疗，防治耐药菌株传 播，具有重要意义。… 微通道电泳芯片是20世纪末出现，在毛细管电泳原理和技术基础上发展起来的一种新的 微量分析技术。是利用微细加工技术在固体基片(石英、硅等)上刻蚀出微通道网络，在其 中实现对样品的电泳分离，并通过光学或化学的方法进行检测。由于其具有分析速度快，检 测灵敏度高等特点，已经有应用于DNA、蛋白质等的分离分析以及手性药物拆分等多方面的报 道。姑·3’ 本文利用实验室构建的微通道电泳芯片分析系统上，对结核分支杆菌耐异烟肼相关的 katG基因和耐利福平相关的rpoB基因的片段进行了单链构象多态性(SSCP)分析，结果成功 实现了对上述基因野生型和突变型片段的快速、灵敏分离，可以作为结核分支杆菌耐药性分 型的依据，为临床用药提供参考。 2．实验部分 2．1试验材料： 所用结核分支杆菌为上海市肺科医院的临床分离株，经提取染色体DNA后，用自行设计 的引物PCR扩增目的片段，并经乙醇沉淀纯化。电泳实验前，将样品在98℃变性5分钟，随 后在冰上冷却5分钟。 2．2仪器及试剂： 所用电泳芯片为本实验室自行设计，以石英基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作；H’ 所用的DNA分析测试仪是由本实验室根据激光共聚焦原理自行设计制作的一套激光诱导荧光 InducedFluorescenceDetection 检测系统(Laser System，LIF)，牾’可实现对芯片泳道中 样晶信号的激发和采集。 过硫酸铵由华美生物工程公司购得，二甲基丙烯酰胺从SIGMA公司购得，TEMED (N，N，N’，N’——四甲基乙二胺)购自amresco公司，吖啶橙为上海化学试剂公司进口分装， 其他试剂为普通的分析纯试剂。 2．3电泳条件： la 筛分介质为3％聚二甲基丙稀酰胺的1×TBE溶液，并掺入0．1 g／ml的吖啶橙作为荧光 素。电泳芯片有效分离长度约为8cm，进样电压为300V，进样时间约30s，分离电压为3．50KV， 电泳运行温度为20℃。 3．结果与讨论 3．1rpoB基因片段突变的分离： 因片段的SSCP电泳图谱有多个峰出现，形成复杂的图谱。野生型的图谱在主峰群之后，约240s 8l 处还有一组峰出现，而各突变型片段这一组峰则缺失，由此可将野生型和突变型加以区分。 圈1．rpoB基因野生型(wT)片段及三种突变型(MT)片段的SSCP电泳图谱 上述突变型1、2、3经测序确定分别为rpoB基因516、531、533位突变。 3．2katG基因突变的分离 katG基因扩增片段长约120bp，其野生型和一种突变型片段SSCP电泳图谱如图2所示， 分别为峰l、2、3的出峰时间。根据实验结果计算得到野生型片段的Q平均值为1．4847，标 因此可根据Q值确定片段是否为突变型()。 图2katg基因野生型和突变型片段的SSCP电泳图谱 经DNA测序确定此katG突变型为具有重要意义的315位密码予上的突变。 3．3讨论： 在上述实验中，rpoB基因片段单链由于可能形成了多种稳定构象，因此电泳图谱较为复 杂；而发生碱基突变后，两单链的某些构象不能稳定形成，造成图谱中的部分峰缺失。katG 基因片段的图谱较为简单，只有3个峰出现，发生突变时使单链的迁移行为发生改变，3个峰 的相对位置发生改变，可以用参数a来考