水质粪大肠菌群操作注意事项-作业指导书.docxVIP

xxxxx环境检测有限公司第1版 第0次修改 作业指导书编制人： 批准人： 批准发布日期：标题：水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书 水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书 本试验基本操作参照《HJ/T 347--2007 水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）》制定此作业指导书。1.培养基、试剂与仪器? 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水；操作者必须建立“无菌概念”和掌握“无菌操作技术”，所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌，试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。? 单倍乳糖蛋白胨培养液：称取23.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的玻璃倒管（杜氏小管）的20x200mm试管中，每试管10ml（注意玻璃倒管中不能有气泡，若出现气泡，可用手指轻弹玻璃管）塞紧塞子，置于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 三倍乳糖蛋白胨培养液：称取69.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中（注意煮沸步骤可能糊底，也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代），其它操作同上。 EC?培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管10ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 伊红美蓝培养基：称取36.0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，分装于三角烧瓶中。于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用。 生理盐水：在烧杯中配制适量的质量分数为0.9%的生理盐水，分装于试管中，每试管9.5mL，于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用。（本实验室中灭菌锅蒸发量为0.5mL） 培养基的存放?：在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。本实验室将培养基放置在4℃冰箱中保存。 实验所需仪器?：超净工作台（有条件的实验室建议使用生物安全柜）、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500mL广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环等，详见附件。2.试验前期准备? 器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口玻璃瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。? 采样广口玻璃瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好；培养皿：将清洗干净的培养皿，用牛皮纸包裹好，用绳子绑好。置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15min。培养皿：（湿热灭菌后4h内采集水样。本实验室采用干热灭菌法，145℃灭菌4.5h。可保存一个月，一个月后重新灭菌。采样瓶要抽样做无菌验证试验。） 玻璃试管（已经装好培养液）：将7支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好，用绳子绑好。生理盐水：将10支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好，用绳子绑好。移液枪枪头（将枪头插入枪盒后，用牛皮纸将其包裹好，用绳子绑好。）置于的高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。（将包裹好灭菌后的枪盒用低温（45℃~72℃）烘干，存放时间更长。） 采样：采取水样时严格按照无菌操作进行，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。（采样体积建议450mL~500mL最好，采自来水或含余氯水样时采样瓶（500mL）在灭菌前应加1.5%硫代硫酸钠2mL。）?采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。?3.水样接种量? 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。? 相对未受污染的水样（自来水、水源水、直饮水）接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样（生活污水）接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL?或0.1mL、0.01mL、0.001mL?等。(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。)如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL（本实验室采用：二倍浓度乳糖蛋白胨培养液10mL）；如接种量为1mL?或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳