DEAE sephrose FF说明及使用.docxVIP

DEAE琼脂糖凝胶FF的详细资料：英文名称：DEAE Sepharose FF CAS号：57407-08-6级 别：BR凝胶类型：离子交换填料，弱碱型结构成分：6%交联琼脂糖粒 径： 45-165μm配基基团：diethylaminoethyl （二乙氨乙基）蛋白质吸附量：110mgHSA/ml凝胶总离子交换量：0.11-0.16mmol/ml凝胶交换载量：3.1mg Thyroglobulin/ml drained medium；110 mg HSA/ml drained medium； 100mg α-lactalbumin/ml drained medium流 速：300~600 cm/h;最大流速750 cm/h工作PH值：2-9工作温度：4-40℃PH稳定性：1~14 (短时间,在位清洗);2~12 (长时间）耐 压：0.3MPa性 状：白色微球,凝胶状、含20%乙醇，底部为乳白色胶体用 途：生化研究、适用于各种带负性电荷生物大分子的浓缩纯化等、利用离子交换作用 ，应 用于蛋白等生物分子的快流速高产量纯化等保 存：2～8℃包 装：100毫升/瓶，500毫升/瓶、1升/瓶等离子交换层析分离蛋白质??【实验目的】通过分离蚓激酶的实验，学习和掌握离子交换层析法的工作原理和离子交换介质的选择；了解离子交换树脂的处理及转型；学习该实验方法的筛选和基本操作技术。?【实验原理】离子交换层析是一种吸附层析，利用不同蛋白质表面电荷的差异而达到分离、纯化蛋白质的目的。阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电,因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应；阳离子交换剂则反之。?【实验材料】0.05M?Tris-HCl?pH7.5、1M?NaCl?0.05M?Tris-HCl?pH7.5、蚓激酶粗提物、20%乙醇、1MNaOH、DEAE-Sepharose?Fast?Flow柱、AKTA?purifier?液谱纯化系统、高速离心机、电子天平、试管、一次性滤器、2ml注射器、2ml?Eppendorf管、冲洗瓶、玻璃滤器?【实验方法】??1离子交换介质：选用Hitrap?DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析柱。蚓激酶的pI为3.5~4.0，洗脱缓冲液为pH7.5，此时pIpH,目的蛋白带负电荷，故选择阴离子交换介质。?2?洗脱缓冲液的选择：选用起始洗脱液为0.05M?Tris-HCl?pH7.5。洗脱液的离子强度及pH可根据具体实验情况而定。一般情况下，起始缓冲液的离子强度应高于10-20mmol/L。?3?样品的准备：称取30mg蚓激酶用起始洗脱液1.5ml溶解配制成20mg/ml溶液。10,000×g离心5min或0.22um膜过滤除去杂质，取上清进样。?4?进样：将样品加入样品环，输入进样程序。?5?设定洗脱条件?起始洗脱液：0.05M?Tris-HCl?pH7.5?5.1梯度洗脱液：1M?NaCl?0.05M?Tris-HCl?pH7.5?5.2洗脱流速：1ml/min?5.3平衡5CV后作梯度洗脱,?梯度为0~1M?NaCl/20CV?5.4梯度洗脱后再次平衡5CV?5.5再生：1M?NaOH反洗3CV?5.6保存：20%乙醇4℃保存?【注意事项】??1?实验用缓冲液均需过滤除去杂质，除去溶液内气体。?2?使用的样品必须过滤或离心除去不溶物，以保持层析柱的使用寿命。?3?层析柱使用后必须再生，保持层析柱使用寿命。?4?选择洗脱液的PH及起始离子强度要合适。DEAE-Sepharose?FF?离子交换层析?①、装柱：20mmol/L?pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子。缓缓倒入DEAE-Sepharose?FF?湿胶约30?ml，待分成后，倒去乙醇溶液，再次加入20mmol/L?pH7.5的Tris一HCl缓冲液。?②、平衡：装柱后，使用?20mmol/L?pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子，速度约为1ml/min。平衡时间为?5h以上，直至液相层析系统记录器显示为基准线。?③、上样和洗涤：脱盐浓缩后的蛋白质样品液5ml上样于离子交换柱。用20mmol/L?pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗，直至冲洗去除杂蛋白后，仪器紫外检测仪出现平稳吸光值（即待穿透峰出现后）。?④、洗脱：用浓度为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mol/L浓度梯度的NaCl溶液进行浓度梯度洗脱(流速为0.6mL/min)。洗脱体积为15倍柱体积，最后以1?mol/L?NaCl溶液彻底洗脱结合蛋白。分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分。