环境微生物基础实验讲义.doc

环境微生物基础 实验讲义  目 录 实验一、光学显微镜对及各类微生物的形态观察 实验二、细菌染色方法及鉴定 实验三、培养基的制备和灭菌及细菌接种技术 实验四、土壤中微生物的分离、纯化及培养技术 实验五、细菌菌落总数（CFU）的测定 实验六、叶绿素a法进行富营养化湖中藻类的测定 实验一、光学显微镜对及各类微生物的形态观察 实验目的 材料显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、镊子蒸馏水、二甲苯、香柏油、擦镜纸。结晶紫染液、红染液、碘液，乙醇（95％）、石炭酸液。菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、 实验内容及步骤 1.机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜。下端装转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式和后斜式。 （2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有孔，不同规格的物镜分别安装在各孔上。 （3）载物台：载物台为方形和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器，可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用的。 （4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器，有固定式和调节式两种。 （5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 （6）调节器：包括粗、细螺旋调节器各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。 2.光学系统和光学原理 （1）目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜 （2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍、高倍及油镜。物镜的性能由数值孔径决定。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径（N.A）为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径（N.A）为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。 显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离ξ的能力。ξ值愈小表明分辨率愈高。ξ值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（N.A）成反比。 （3）聚光器: 聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到样本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可上下调节，中间装有光圈，可调节光度。 （4）反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。 （5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某些波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和分辨率。 显微镜的操作方法 1.低倍镜的操作 （1）置显微镜于固定桌上。 （2）旋动转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。 （3）转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜，仔细观察。 （4）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。 （5）将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。 （6）左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转。如果粗调节器旋的太快，使超过焦点，必须从第五步重调。 （7）观察时两眼同时睁开。 2. 高倍镜的操作 （1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中央。 （2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调，如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。 3. 油镜的操作 （1）如果高倍镜的目的物没有看清，用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本，将目的物移到视野正中。 （2）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。 （3）从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 （4）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。 （5）再次观察，提起镜筒，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 镜检完毕后的工作 1．移开物镜镜头。 2．取出装片。 3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二