PCR-DGGE实验.doc

2 实验流程 提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验 用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验 DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化 用不带GC发夹的引物进行PCR 连接转化，需要用到感受态细胞 菌落PCR进行验证 2.1 DNA提取 用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。 2.2 琼脂糖凝胶电泳 将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3μL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。 将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm电压下电泳30min。 在紫外光下观察电泳条带。 2.3 PCR反应及产物纯化 采用25μL的反应体系： PCR反应体系成分 终浓度 GC Clamp-F 0.2 μM 引物R 0.2 μM Mg2+(MgCl2) 0.5 mM BSA 0.2 mg/l Taq DNA Polymerase 1.25 U 10×Taq Buffer 1× dNTP Mixture 0.2 mM DNA模板 1 μl dH2O To 25 μl 反应条件： 94 ℃预变性4 min 94 ℃变性秒， 65 ℃复性秒， 72 ℃延伸秒，共个循环 72 ℃最终延伸5min。 PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。并用紫外分光光度计测定DNA浓度。 2.4 DGGE 2.4.1 药品配制： 1）40%聚丙烯酰胺 丙烯酰胺 38.93 g 双丙烯酰胺 1.07 g dH2O To 100 ml 2）0%变性剂 6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 50×TAE缓冲液 2 ml 2 ml 2 ml dH2O 83 ml(to 100) 78 ml 73 ml 68 ml 脱气15min，用0.45μm的滤膜过滤。于棕色瓶中保存在4℃环境中。 3）80%变性剂 6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 50×TAE缓冲液 2 ml 2 ml 2 ml 甲酰胺 32 ml 32 ml 32 ml 32 ml 尿素 33.6 g 33.6 g 33.6 g 33.6 g dH2O 83 ml(to 100) 78 ml 73 ml 68 ml 脱气15min，用0.45μm的滤膜过滤。于棕色瓶中保存在4℃环境中。 4）APS 过硫酸铵 0.1 g dH2O 1 ml 5）凝胶加载染料 2%溴酚蓝 0.25 ml 终浓度0.05% 2%二甲苯 0.25 ml 终浓度0.05% 100%甘油 7 ml 终浓度70% dH2O 2.5 ml 2.4.2凝胶的制备 1.将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统。 2.配制变性浓度为40%和60%的丙烯酰胺溶液到两个离心管中：3.75 ml的0%的变性剂与11.25 ml的80%的变性剂混合得到变性浓度为60%的丙烯酰胺溶液（高浓度）；0%的变性剂与80% 的变性剂各7.5 ml混合配得40%的丙烯酰胺溶液（低浓度）。 3.每个离心管加入120 μl的10% APS和12 μl的TEMED，迅速盖上盖帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的凝胶，用连有聚乙烯管标有“低浓度”的注射器吸取所有低浓度的凝胶。通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。 4.将两个注射器安装到梯度传送系统上固定好，再用Y形管将高、低浓度注射器上的聚乙烯管和针头端的聚乙烯管相连。 5.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中，且凝胶中不能出现气泡。 6.小心插入梳子，让凝胶聚合约4小时。 2.4.3电泳 1.打开电泳控制装置，预热电泳缓冲液（1×TAE缓冲液60 ℃。 2.凝胶聚合完毕后拔下梳子，用去离子水清洗点样孔。 3.将DNA与凝胶加载染料混合，用微量注射器加样，由于DGGE加样量一般不超过500 ng，混合样品的加样量为15 μl。 4.将胶放入电泳槽内，另一侧一定要有对称的制胶板系统来平衡。 5.电泳：先用100 V电压电泳30 min，然后再用65 V电压电泳16