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FISH技术 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 　　FISH技术：荧光标记的原位杂交技术 　　1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。 　　1．原理 　　将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 　　 肺肿瘤细胞FISH 2．实验流程 　　FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 　　3．特点 　　原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 　　缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 　　4．应用 　　该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交（FISH）技术的发展和进步 　　FISH技术显示核酸是在同位素标记探针的基础上改进而来的。早期的同位素标记没有专门的标记方法，如将随机同位素标记的碱基添加到生长的细胞中之后再进行放射自显影。同位素杂交的诸多缺点必然要求用更好的技术来取而代之。首先，放射性材料决定了探针的不稳定性，特别是半衰期较短的同位素随着时间推移不断衰退而造成探针的活性不能持久。其次，虽然放射显影的灵敏度极高，但是分辨率（清晰度）有限。第三，为了在放射显影底片上获得可检测到的信号往往需要延长曝光时间，使检测周期变长。第四，放射性标记探针相对比较昂贵，并且必须按照严格的程序转运、贮存、处理带有放射性的材料。而FISH 技术在分辨率、检测周期、安全性等方面明显得到了改进，并为以后的多位点检测、高质量分析、活细胞绘图等打下了基础。 　　1980 年，Bauman 首次将荧光原位杂交用于核酸检测，直接将RNA-3’端用荧光素标记作为特异DNA 序列的探针 。嵌入整个探针的酶结合荧光素标记碱基方法已经广泛用于荧光探针的制备；一次可以标记一种颜色。氨基-烯丙基标记碱基技术可以与任何半抗原或者荧光素结合，这对于原位杂交是至关重要的，因为氨基-烯丙基标记的碱基技术可以仅通过简单的化学反应就可以获得一系列的低背景信号探针，通过杂交探针的二级检测系统使得杂交信号被放大。早在19 世纪80 年代，缺口平移法检测、生物素标记探针，二级荧光标记抗体检测等方法已经用于DNA 和mRNA检测。约十年后，单链DNA 探针的合成、标记方法的不断改进可以使合成的杂交探针携带大量的荧光素分子用于直接检测。在这些方法基础上，有许多关于不同的检测范围、特异性，灵敏度以及分辨率等直接的或间接的改进技术方面的报道。 　　1 FISH 技术检测位点数目及检测目标的发展 　　在FISH 技术基本确立之后，FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。早期的探针较大，是通过载体的增殖、缺口平移法、体外转录法和随机引物DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆。然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景，采用未标记的核酸进行预处理使其