基因工程概论重点总结 3-DNA重组克隆的单元操作.docVIP

基因工程概论重点总结 3-DNA重组克隆的单元操作 1．用于DNA重组克隆的载体的功能是什么 ①运送外源基因进入受体细胞②为外源基因提供复制或整合能力③外源基因提供扩增和表达的必要条件 必须具备四个条件： ①丰富的酶切位点②对受体细胞有可转移性③在受体细胞中稳定遗传④具有合适的标记，便于检测。 2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么 自主复制性：不依赖于染色体DNA，自主复制 可扩增性：G-菌种松弛型复制和严谨型复制 可转移性：结合性，能转移到另一菌体中，基因工程用非结合型 不相容性：对已经侵染的质粒或类似质粒免疫 3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义 具有相同或类似复制子结构或调控模式的两种不同质粒不能稳定存在于同一个受体细胞中 4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途 高拷贝：突变拷贝基因，拷贝数1000-3000，用于扩增基因 低拷贝：来自pSC101，拷贝数低于10，表达毒性基因 温敏：在不同温度下表现出不同的拷贝数 测序：含有测序通用引物互补序列与多酶接头 整合：装有整合促进基因和位点，便于外源基因整合到染色体DNA上 穿梭：装有针对两证不同受体的复制子，便于基因克隆 表达：装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化原件 探针：装有报告基因便于启动子等原件克隆筛选 COS质粒：由λ-DNA的cos区域质粒DNA重组组成 5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么 分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别和切割位点具有严格特异性 6．在DNA重组克隆实验中为什么通常使用T4-DNA连接酶而不用其他连接酶 1．有更广泛的底物适应性 2．修复DNA-DNA链上的单链缺口（大肠杆菌也有）、DNA-RNA杂交链上的缺口 3．连接平头双链DNA分子 7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别 大肠杆菌DNA聚合酶I在枯草杆菌蛋白酶处理下获得的C端2/3的肽段。 Klenow酶：具有5’→3’DNA聚合酶活性，3’→5’核酸外切酶活性，缺失5’→3’核酸外切酶活性 8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？ ①温度、盐度等物理因素②DNA样品纯度③DNA甲基化程度④限制性核酸内切酶的缓冲液性质. Star(星号)活性：极端条件下限制性核酸内切酶的专一性变低，会识别和切类似切口。 9．如何理解粘性末端比平头末端更容易连接？ 粘性末端在退火条件下为分子内反应；平头末端是分子间反应，反应更加复杂，速度也慢 10．在重组DNA技术中常使用的微生物转化方法有哪些？ G-菌：Ca2+诱导转化（形成液晶，便于DNA分子进出） 有细胞壁：PEG介导（先溶酶体去壁，加入DNA转化，再生细胞壁） 电穿孔：电场脉冲下直接处理。 11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞 ①外源DNA会被识别，从而被降解②即使被转化进去，重组质粒的逃逸③转座元件促使重组DNA的缺失和重拍④影响细胞代谢，使得工程菌生长慢于普通菌 12．简述转化率和重组率的基本概念以及在DNA重组克隆实验中的指导意义。 转化率：每微克载体DNA转入受体细胞的分子数 重组率：含有外源DNA的重组分子数/载体分子数(一般25%-70%) 指导意义: 某DNA重组实验的重组率为20%转化率为107每微克,经过处理后的载体转化率吧要比天然的降低100倍.要获得104个重组克隆,需要多少载体DNA进行重组实验: 解: 处理后的重组DNA转化率=105每微克 重组率100%条件下需要：104/105=0.1微克 0.1/20%=0.5微克载体DNA 13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略 载体遗传标记检测 抗药性检测 营养缺陷型检测 显色筛选 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 菌落原位杂交法 PCR扩增法 DNA序列分析法 外源基因产物检测 蛋白质生物功能检测法 DNA结合蛋白检测法southern western检测 抗菌素抗性鉴定 放射免疫原位杂交鉴定 免疫沉淀 聚丙烯酰胺凝胶法，找粗条带 14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是 探针：小段单链DNA或RNA，用于检测与其互补的核酸序列 引物：小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起点 接头：平头双链DNA，更换粘性末端 15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围 ①鸟枪法：原核细菌目的基因的克隆②cDNA法：获得mRNA，除去内含子③PCR法：知道基因的两侧序列或中间序列④化学合成法：知道全基因序列 16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。 基因文库：含有全部基因 鸟枪法获得 cDNA文库 含有全部蛋白质编码基因 cDNA法获得 基因文库的完备性：f增大 N增大用装载量