猕猴重构胚和大熊猫异种克隆研讨.pdfVIP

称猴重构胚和大熊猫异种克隆研究 杨 彩 侠 导 师:陈大元 研究员 摘 要 动物克隆技术在动物发育生物学、动物遗传学、动物资源保护、动物遗传育 种、医药等方面具有广泛的潜在应用价值。异种克隆可能成为高度濒危动物保护、 治疗性克隆和核质互作关系研究的一种有效方法。本论文试图以异种克隆技术为 手段，为建立 “治疗性克隆”非人灵长类动物(称猴)模型和克隆大熊猫，进行一 些技术上的可行性探索和理论上的初步研究。 成功分离培养了具有正常形态大小、细胞骨架系统和染色体数目的称猴耳皮 肤成纤维细胞。利用流式细胞仪对培养细胞的周期特性进行了测定，表明随着细 胞汇合程度的增加，Go/G。期细胞所占的比例上升，S期比例显著下降;不同代 细胞间的周期比例没有显著差异:血清饥饿处理的细胞与90%以上汇合生长未经 处理的细胞周期比例没有明显的差异。将称猴成纤维细胞移植入 Mil期去核的 兔卵母细胞中，构建的称猴一兔重构卵在HECM;o+10%FBS或G1.2/G2.2体外培养 体系中可经过卵裂发育至囊胚阶段。通过染色体分析和微卫星DNA分析两种方 法分别检测了称猴一兔异种重构囊胚的核遗传物质来源，结果均证明重构囊胚的 核遗传物质来源于供体细胞。对 1一细胞至囊胚期各阶段的称猴一兔重构胚胎中称 猴供体细胞和兔受体卵母细胞来源的线粒体命运进行了定性分析，发现植入前各 期克隆胚胎中两种来源的mtDNA呈异质共存;进一步利用实时检测定量PCR 分析了两种不同来源的线粒体在重构胚早期发育中的动态变化，结果表明单个重 构胚中，两种MONA拷贝数在1一细胞至桑堪胚期的体外发育过程中没有明显的 变化:但在囊胚期，赘猴mtDNA拷贝数明显降低，兔mtDNA拷贝数迅速升高， 供体称猴与受体兔mtDNA拷贝数之比也从1一细胞期的2%降至囊胚期的0.011%; 在整个体外发育过程中，兔卵胞质来源的mtDNA始终占主导，且其可能在桑框 胚期后开始复制，线粒体增殖。 在大熊猫一熊异种克隆研究中，首先建立了熊的超排程序，比较了FSH注射 剂量、重复超排次数和品种对熊超数排卵的影响;并优化了熊卵母细胞体外成熟 的条件，为熊的辅助生殖和大熊猫异种克隆提供了重要参数。分别把大熊猫和黑 熊的成纤维细胞移入去核的黑熊受体卵母细胞中，得到了77枚大熊猫·黑熊异种 重构胚胎和21枚黑熊一黑熊同种重构胚胎，移入16头受体熊后，于胚胎移植后120 天经超声波检查发现有一头妊娠，但无胎儿心跳。胚胎移植后169天，剖检发现 该头受体熊怀有7个胎儿，怀有5个胎儿(编号为1-5)的右侧子宫角被手术切掉进行 胎儿的核遗传物质来源和mtDNA分析。用大熊猫核甲状腺紊运转蛋白基因内含 子1的特异引物进行PCR分析，表明2号胎儿可能来源于大熊猫重构胚胎，但该胎 儿组织中检测不到大熊猫来源的mtDNA。实验结果显示，熊是大熊猫近缘动物 中一种可能的卵胞质供体和寄母受体。 关键词 称猴，大熊猫，异种克隆，线粒体命运 StudiesonReconstructedEmbryosofMacaque(Macaca mulattatcheliensis).andInterspeciesCloningofGiantPanda (Ailuropodamelanoleuca) Cai-XiaYang(M习or:Physiology) Directedby:Prof.Da-YuanChen ABSTRACT Animalcloninghaspotentialapplicationvalueinfundamentalbiology,suchasanimal developmentalbiologyandgenetics,preservationofanimalresources,pharmacology etc.Furthermore,interspeciescloningcouldpossiblybeaneffectivemethodto protecthighlyendangeredanimals,andestablishtheanimalmodelsofthe nuclear-cytoplasminter