猪瘟病毒E2基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 本文利用反转录PCRCRTPCR)和套式PCR(nPCR)技术，对流行于国内部 分地区的9株猪瘟病毒 (CSFV)E2基因进行克隆，并对其核昔酸及氨基酸序列的 同源性进行比较及分析，绘制了系统关系发生树，以期了解近期猪瘟流行野毒主要 保护性抗原E2基因的变异情况，为猪瘟的防制提供分子流行病学方面的资料。同时 以1株 (陕西周至株)为材料，在昆虫细胞中进行表达，为新型猪瘟基因工程亚单 位疫苗的研制奠定了基础。 (1)采用RT-PCR和nPCR扩增出9株国内近期猪瘟流行野毒株的E2基因， 将其分别克隆于pMD18-T载体并进行核昔酸序列测定，根据C一株，Brescia株，Alfort 株及Shime株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导，并进行了 同源性比较，绘制了系统关系发生树。结果表明所测9株CSFVE2基因的长度均为 1324by，编码的氨基酸序列均包括完整信号肤序列和跨膜序列，共由442个氨基酸 残基组成。可将13株(包括4株参考毒株))CSFV分为两个组群，GXGL，GXNN LNAS,SDJN4株毒株与C株，Shimen株，Alfort株和Brescia株同为一个群组， 其E2基因间的核普酸序列同源性为94.00/6^-99.4%，所推导氨基酸序列同源性为 93.7%^99.5%eHNLS，SXZZ，HNCA，HNXY和HNDX5株同为另一群组， 之间核昔酸序列同源性为 81.9%~99.7%.所推导氨基酸序列同源性为 88.2%一 99.1%,13株E2基因间的核昔酸序列同源性为81.9%^99.7%,所推导氨基酸序列 同源性为88.2%^-99.5%，其中9株流行野毒与4株参考毒株之间核昔酸序列同源性 。为81.9%98.9%，所推导氨基酸序列同源性为88.2%^99.5%·说明近期流行毒株 的变异呈现一定的多样性。通过对主要抗原区域氨基酸位点变异进行分析，发现各 毒株间抗原决定簇未发生明显的变异。 (2)对己知的E2基因进行分析后，用聚合酶链式反应 ((PCR)从陕西周至株 克隆化E2全基因中扩增出除去3端跨膜区的特异性片段 (1033帅)，并在其两端引 入BamHI和HindIII酶切位点，将其亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb，获 得重组质粒pFBHT-E2，转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DHlOBac，得到含 E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2，以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染 sf9 昆虫细胞，经SDS和Western-blotting及ELASA等方法检测，结果表明，此 E2基因在昆虫细胞中正确表达，表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 关键词:猪瘟病毒:E2基因;序列分析:杆状病毒表达载体系统:表达 英文摘要 Abstract ThepapercomparedthedifferationofE2genenucleotideoffourreferencestrains and9prevalentstrainsclassicalswinefevervirus(CSFV);theotherisE2geneofCSFV wasexpressed ininsectcell. (1)TheE2geneofnineprevalentvirulentstrainsofCSFVwereamplified勿reverse transcriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)andthenestedPCR(nPCR),Thenthem wereclonedandsequenced,compareredwiththepublishedsequencesofCSFVC-strain, Brescia,AlfortandShimestrain.Thephylogenetictreewasconstructedbasedon sequencecomparionandanalysis.Theresultindecatedthattherewereatleasttwo subgroups,GXNN,GXGL,LNAS，SDJNandC-strain,Brescia,Alf