中国白兔IL6基因的分子克隆及其表达研讨.pdfVIP

全国兽医外科学第13次学术研讨会小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会论文集 —rI-—一 达系统来制备具有生物学活性的IL-18蛋白是非常困难的，因此下一步我们将利用毕赤酵母或杆状病毒表 达系统来表达猫Ⅱ，18，探讨重组猫儿一18的生物学活性，为其在治疗猫科动物病毒性感染的实用化研究奠 定基础· 中国白兔IL．6基因的分子克隆及其表达研究· 孟庆玲“2，才学鹏”．乔军1，景志忠1。张艳“。 (1中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学图家重点实验室甘肃兰州730046：2甘肃农业大学动物医学院， 甘肃兰州730070) 其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列．与不同物种IL-6基因相比，核苷酸和推导的氨基酸序列有一定 可检测到相对分子量为29．5kDa的重组目的蛋白．经凝胶薄层扫描，目的蛋白表达量可占茵体蛋白的 16．2％． 关犍词 中国白兔白介素6基因；分子克隆；表达 白介素6(IL一6)作为一种机体内复杂的细胞因子网络中的关键成分，它具有多种生物学功能n’31，不 但能影响B细胞和T细胞的增生和分化，还能使造血干细胞或颗粒细胞／巨噬细胞形成克隆，并刺激其生 长，该细胞因子已引起了人们极大的关注。为了进一步探讨IL-6的生物学功能，本试验对中国白兔IL_6 的cDNA进行了序列分析并在E．coli中对其进行了表达，为重组兔IL-6的开发利用奠定基础。 1材料和方法 1．1主要试剂、质粒及菌株 · Taq DNA聚合酶、DNAExtraction plus gel 由本室保存。 1．2中国白兔外周血淋巴细胞的制各及总ILNA的提取 对健康的中国白兔进行心脏采血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离兔外周血淋巴细胞(PMBCr)，用 X Hanks液洗涤3次后进行计数，调整PMBCr至1．5 10mg／L ConA以及青、链霉素1000 PMBCr的总RNA。 1．3引物的设计与合成 根据GenBank中报道的参照已发表的欧洲兔IL-6cDNA序列，设计了特异的引物P1和P2，扩增预期长 I和 H／Mill酶切位点，并加有三个保护碱基。引物由大连TaKaRa公司合成。 18l 武汉华中农业大学 2006．10 1．4中国白兔几．6基因RT-PCR扩增，克隆及序列测定 IlL，10×PCRbuffer p 产物2 5“L、25mmol／LL、弓I物P1(25pmol／p MgCl24 2．5mmol／L L(5U／uL)混匀。PCR反应条件为96 dNTPs各4uL，水32．7lIL，TaqplusDNA聚合酶0．3ll ℃预变性200 Extraction 琼脂糖凝胶电泳分析。切下目的DNA片段，按DNA Kit说明书进行回收。取回收DNA片 gel 海生工进行序列测定。所测序列用DNASTAR进行分析，并与不同生物物种IL．6基因进行遗传进化分析。 1．5原核表达载体pETIL-6的构建 接进行定向克隆，构建原核表达载体pETIL-6，并用酶切和PCR进行鉴定。 1．6重组质粒pETIL-6在大肠杆菌中的表达及表达产物的鉴定 IJLTE 目的蛋白的表达情况，并用双波长非点扫描仪对上述凝胶电泳的蛋白带进行扫描。 2结果 2．1中国白