探讨蛋白质印迹法操作过程中的实验方法.docVIP

精品论文 参考文献 探讨蛋白质印迹法操作过程中的实验方法 成都市实验外国语（西区）中学2014级1班 610213 　　摘要：蛋白质印迹法是一种被广泛的应用于分子生物学、生物化学以及免疫遗传学的实验方式，其最基本的远离便是把经过电泳分离之后的细胞或者组织蛋白，由原本的凝胶，转移至固相支持物上，之后，再通过抗体检测对其进行着色，按照着色的位置以及颜色的深度，将蛋白质的实际表达情况体现出来。基于此，本文从蛋白质印迹法的实验原理入手，详细探讨了具体操作中的实验方式。 　　关键词：蛋白质印迹法；实验操作；试验方法 　　蛋白质印迹法也被叫做免疫印迹法，它能够对固定在某一个固相载体上面的蛋白质做出检测的。当然，待检测的蛋白没有特殊的固定，可以是粗提物，也可以是经过了分离和纯化后的。从其实验方式来看，其原理以及操作过程相对比较简单，但是，每一个简单步骤的背后，需要对其进行细化，而这些细化的操作容不得半点马虎，稍有疏忽便会对结果造成影响。 　　一、蛋白质印迹法操作的实验原理 　　蛋白质应印迹法主要是针对蛋白质实施的检测，其中，将抗体用作探针，二抗作为显色。整个实验过程，是通过凝胶电泳的方式，把样品的蛋白质做出分离，之后，再将其移至固相载体，国祥载体通过非共价键的方式，对蛋白质产生吸附作用，同时确保了电泳分离的生物活性不发生变化，再将固相载体上的蛋白质作为抗体，让其和对应的抗体产生免疫作用，值得注意的是，与之对应的抗体我们称之为一抗。特异性一抗和酶偶联的第二抗之间再发生反应，以酶作为载体，最终使得底物显色，通过颜色的深浅和显色的位置，我们就能够将蛋白质的实际表达检测出来。 　　二、蛋白质印迹法操作的实验方法 　　制胶 　　首先，我们需要结合待检测蛋白的性质，选择与之相适应的电泳方式对其实行分离。其性质包括了分子量、分子大小、电荷以及等电点等。通过电流，再将凝胶中的蛋白质转移，当其完全转移至聚偏二氟乙烯膜上之火，再通过与之对应的抗体（上述说过，即一抗）发生反应，形成特异性一抗，将抗体作为探针，将目的蛋白提取出来。值得注意的是，凝胶质量的好坏，会对后续实验产生比较大的影响，所以，在具体操作中，必须要对下面几点引起重视： 　　第一，分离胶以及浓缩胶这些可以在事先就进行配制，除了四甲基乙二胺还有规格为10%的过硫酸铵，其余的在过滤完毕后，都应该存放在4摄氏度的环境中，等需要使用之前，再将其取出来，在常温下带起平衡之后，再使用。其根本目的是为了使凝胶这一过程产生的热量会把低温状态下溶解在存储夜中的气体被析出来，从而产生气泡。 　　第二，使用过硫酸铵的比例应该保持在0.7：100-0.8：100这一范围内，并且往往分离胶的浓度和过硫酸铵的浓度成反比，即前者越高，后者则越低。 　　第三，过硫酸铵必须保证新鲜，如果能够现配现用就再好不过了，当然，不得不强调，在4摄氏度的环境下存放时，一定要保证在两星期之内使用。 当然，除此之外，也可以挑调配好的过硫酸铵进行分装处理，之后将其存放于零下20摄氏度的环境中，随时等待提取使用。 　　第四，要保证混合之后的凝胶不出现气泡，不然会对其聚合造成影响，最终在电泳过程中出现电泳带畸形问题。 　　电泳 　　等到制胶完毕，就进入到了电泳阶段，将之前变性好的蛋白样品进行电泳分离，之后再采用电泳把蛋白质转移至固相载体，这一过程也是我们所说的电泳印迹。如果可以，电泳之前尽可能的把蛋白样品实行瞬时离心处理，在轻轻摇晃混合均匀完毕在实行。保证加样时间越短越好，其目的是防止样品扩散开来。同时，为了使得边缘效应现象不出现，可以在没有加样的孔中，放相同数量的样品缓冲液。做到这些，在之后的操作中，就只需要把电流强度掌握好，便能够参照预染蛋白Marker，将目的蛋白的位置确定好，随时可将电泳过程停止。 　　当然，在电泳时，免不了会产生一些特殊情况需要我们引起重视：第一，如果条带呈现出笑脸状态，是因为凝胶冷却时没有混合均匀，中间冷却工作没做好。第二，如果条带呈现出皱眉状态，不是因为装置不合理，便是凝胶和玻璃挡板底部出现了气泡。第三，如果条带出现拖尾现象，说明蛋白样品未溶解完全。第四，如果条带呈现出纹理状态，说明样品中有可能存在如法溶解的颗粒物。 　　转膜 　　等到电泳分离之后，就进入到了转膜阶段，也就是要从凝胶转移至膜上进行固定，之后对蛋白做出检测和显色。当然，转膜的过程一定要保证在最快的速度内完成好，从而避免了被分离好的蛋白条带，处于无电场状态下被扩散。具体转膜的过程包括了四个步骤： 　　第一步，转膜的装置由下到上包括了阳极碳板、三层厚滤纸、尼龙膜、凝胶、三层厚滤纸、阴极碳板。同时，要保证履职、凝胶以及尼龙膜之间完全对其，每一步都无气泡产生。 　　第二步，采用支架把上面这些夹紧，再将其放于电转移槽中，将NC膜一侧接近正极，把凝胶一侧接近负极。在4