靶向慢病毒载体RNA干扰小鼠血管内皮细胞异种抗原的研究.pdfVIP

生堡墨：宦整焦盘查垫!!生!!!旦筮i!鲞箜!!塑垦h也』Q!g垫!塑!Pk坠!!Q!!里b!!垫!Q!y吐i!：丛垒!! 实验研究 靶向慢病毒载体RNA干扰小鼠血管 内皮细胞异种抗原的研究 戚峰谷雅川 吕承育 章志翔何向辉朱理玮 【摘要】目的使用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)方法抑制小鼠血管内皮细胞异种抗原半 乳糖a1。3一半乳糖(Galal，3-Gal)的表达。方法 经体外设计合成针对a1，3一半乳糖基转移酶(a1，3一 GT)mRNA的序列特异性小发夹RNA(shRNA)，并构建携带a1，3一GTshRNA的重组慢病毒载体， 以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EDM4细胞。采用荧光实时定量聚合酶链反应检测转染后的 E()^似细胞al，3-GT mRNA表达水平的变化；免疫荧光法和流式细胞术检测转染后的E(舭A细胞 异种抗原Galal，3-Gal表达水平的变化。并将转染后的EOMA细胞与人血清混合培养。用四甲基偶 氮唑盐比色法测定细胞存活率。结果成功获得携带al，3-GTshRNA的成熟重组慢病毒颗粒，转 染EOMA细胞效率可达75％，与空白对照组、空转染组以及阴性siRNA对照组比较，重组慢病毒 转染EOMA细胞后，能有效抑制al，3-GT的表达，抑制率为88％(Po．05)；Galal，3-Gal抗原表达 水平明显降低(Po．05)；而空白对照组、空转染组和阴性siRNA对照组间的差异无统计学意义(P o．05)。重组慢病毒转染后的EOMA细胞与人血清混合培养后的存活率较各对照组明显提高(P 0．05)。结论成功构建靶向a1，3一GT基因的重组慢病毒载体，通过RNAi沉默al，3-GT基因，抑 制EOMA细胞异种抗原Galal，3-Gal的表达。在体外实验中可减轻异种超急性排斥反应。 【关键词】异种移植；RNA干扰；慢病毒；超急性排斥反应 RNAi Lentivirus-mediated inmousevascularendothelialcellsQI y口一 againstxenoantigen Feng，GU ch獬行，LU(孺eng-yu，ZHANGZhi～xiang，HEXiang-hui，ZHULi一讹i．Department0厂General Medical General 300052．China Surgery．TianfinUniversityHospital。Tianfin To the of Gala(1。3)一Gal in [Abstract]Objectiveinvestigatefeasibilityinhibiting expression mousevascularendothelialcells RNAi．MethodsTheshRNA bylentivirus-mediated specifiedtO a1，3一GTmRNAwas and invitroandclonedintothelentivirusvector．E：()MrA designedsynthesized cellswereinfectedrecombinantlentivirus．Real—timeRT—PCRwasusedto detecttuRNA by levelsof aSwellasimmunofluorescenceandflow were tO a1．3一GT cytometry transcriptional applied and detectGale(1，3)一Gal1evelafter transfe