nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建.pdfVIP

第29卷第1期 黑龙江大学自然科学学报 VoL29No．1 NATURAL 2们2年2月 JOURNALOF SCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERS兀Y February，2012 加扣基因的克隆及其导入大豆根 瘤茵工程菌株的构建 刘金玲， 张喜波， 贾珊珊， 平 原， 李海英 (1．黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨150080；2．黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500) 技术。克隆结瘤基因nodD编码区序列；利用DNA重组技术，将nodD基因连到lac启动子的下游， 将构建的表达栽体转化土著大豆根瘤茵，构建转基因工程茵株，为研究转基因工程茵株对大豆结瘤 能力的影响提供依据。 关键词：大豆根瘤茵；nodD基因；工程茵株；三亲本杂交 中图分类号：s566．3；S188文献标志码：A O 前 言 从1862年发现生物固氮现象起，对生物固氮作用的研究领域涉及到形态结构、细胞水平、分子水平及遗 传等诸多领域。目前生物固氮仍然是生命科学研究中的重大课题，而且在农业生产中也具有重要的应用价 值[1。4】。生物固氮不仅固氮量大，而且还可以提高土壤肥力，改善土壤板结情况，减少化肥的使用量，不污染 环境；更为重要的是它有取之不尽，用之不竭的廉价氮源，常温常压下可以固氮，成本低，利用率高。因此，生 物固氮是今后肥料发展的主要方向之一。黑龙江省是我国大豆的主产区，年播种面积、总产量和出口量均居 J。 全国首位，加强生物固氮作用的研究及应用对提高我省大豆的产量有重要意义。7 根瘤菌中的结瘤基因在根瘤菌与植物形成互利共生关系的过程中起到重要的作用。结瘤基因从功能上 可分为调节基因和结构基因两大类，调节基因对植物信号分子产生应答后激活其它结瘤基因转录，如nodD 4‘。 基因，它编码的蛋白NodD是连接植物信号(主要是黄酮类化合物)和细菌信号(结瘤因子)的桥梁悼。1 土著大豆根瘤菌中，构建转基因工程菌株，为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响奠定基础。含有 luxAB基因编码的发光酶，在还原型黄素单核苷酸存在下，氧化底物癸醛并产生发光现象，便于今后对所构 建的转基因工程菌株进行检测。 1材料和方法 1．1供试菌株 DHSa。 快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)15067；土著大豆根瘤菌；E．coli 收稿日期：2010～∞一20 人才(创新团队)支持计划资助项目(Hdtd20i0一05) 作者简介：刘金玲(1984一)，女．硕士研究生，主要研究方向：分予生物学 通讯作者：李海英(1968·)，女，教授，博士．博士生导师 122· 黑龙江大学 自 然科学学报 第29卷 1．2质粒载体 1．3 nodD基因的克隆 VectorK／t进行 (p1，p2)，采用PCR方法扩增目的基因∞dD全长DNA。反应后，回收PCR产物与pMDl8一T 连接并转化至E．coliDH5a。送与博亚生物公司进行测序。 1．4重组载体pTRl02一Pk—nodD的构建 表达载体pTRl02一Pk-nodD。 1．5转基因工程菌株的构建 采用三亲本杂交的方法，将重组载体pTRl02-P 结果记录。 2结果与分析 2．1 nodD基因的克隆与分析结果 以快生型大豆根瘤菌15067的基因组DNA为模板，采 用PCR方法扩增目的基因nodD全长DNA检测结果如图1