家兔移植性肝细胞癌模型的建立研究.pdf

、扣陶农业凡学博士学位论史 摘要 摘要 目的建市二乙基亚硝胺(DEN)诱发家兔肝癌模型，获得家兔肝细胞癌裸鼠移植株和细胞 系，开展家兔肝细胞癌同品种兔体内移植研究，初步探讨动物移植性肿瘤的可移植性机制，为 肝癌研究提供新的实验材料和手段。方法q340只雄性日本大耳白兔，在1／6肝切除手术后， 以浓度为o．002％的DEN水溶液代替饮水投喂，4周后DEN浓度降至O．001％，直至实验结束。 实验过程中，定期检测血清GOT、GPT、卜—GT及AFP：定期作超声检查：定期处死动物做肝 脏病理学动态观察：对存活至23个月的5只动物取直径0．8cm以上的肿瘤性结节(5个，抨)， 做HE染色，核仁组成区嗜银相关蛋白染色，以及C．myc、P53蛋白和AFP免疫组化染色，光 镜观察；每例肝脏肿瘤周时做透射电镜检查。②以上5只家兔各取】块肿瘤组织接种裰敏，成 活的移植瘤在裸鼠体内反复传代，在第10代和第15代对肿瘤的生长特性、病理形态进行观察。 另取第4代裸鼠移植瘤体外培养，在培养4个月后检测细胞形态、生长曲线、肿瘤标志物，进 行染色体分析、裸鼠成瘤试验。③将建立的裸鼠移植瘤和细胞系分别在家兔皮下、腹腔、肝脏、 眼前房接种，同时皮下注射lOmg／kg／d的环孢霉素A(CsA)，观察肿瘤生长情况。此外，还通 过对应用大剂量CsA、家兔血清对肿瘤细胞的体外适应诱导和主要组织相容性抗原在肿瘤可移 植性中作用机制的探讨，寻找建立家兔移植性肝细胞癌模型的新途径。结果与结论本实验用 DEN成功地诱发了家兔肝脏肿瘤，每只家兔应用DEN的总剂量约为4010～4550mg，诱发周期 19～20个月，肝癌的发生率为9／11；DEN诱发家兔肝癌的肝脏病理变化过程与诱发大鼠肝癌 的变化类似，但是家兔肝脏病理变化各个阶段的病程明显长于大鼠：DEN诱发的家兔肝脏肿瘤 均为弥漫性多结节性肿瘤，同一肝脏的不同肿瘤结节性质存在不同：DEN诱发家兔肝癌的发生 与c_myc基因祁AFP的过表达以及p53基因的突变有关，本研究结果支持在肝缅胞癌癌变过程 中，c—myc基因的异常表达出现较早，p53基因的突变为肿瘤发展后期事件的观点；本研究获得 了一个家兔肝细胞癌裸鼠移植株，该瘤株基本保留着原发瘤的形态学特点，分泌AFP。接种操 鼠的潜伏期8d左右，成瘤率10／10，生长缓慢，无自发消退；本研究获得了～个家兔肝细胞癌 细胞系，该细胞系的细胞呈上皮样形态，染色体众数集中在66～76之阃；兔肝细胞癌裸鼠移植 瘤和细胞系在应用10mg／kg／d的CsA条件下，接种同品种家兔未能成活，在CsA的剂量增加至 20mg／kg／d时，移植瘤得以生长，但是荷瘤家兔呈恶病质状态；家兔肝细胞癌细胞在体外能够 逐渐适应含兔血清的培养液；小鼠移植性肿瘤H22的可移植性与主要组织相容性复合体(H．2) 有关，可能是在mRNA至蛋白表达之间的某种调控机制造成了移植性肿瘤H．2分子在细胞 表面表述的下调，这些探讨为建立大型动物的移植性肿瘤模型提供了新的思路。 关键词：二乙基亚硝胺；兔；肝癌；裸鼠；细胞系 2 巾国农业大学博士学位论文 英文摘要 ABSTRACT Toinducerabbit tumors establisha obiective hepatic bydiethylnitrosaminefDEN),then and tumorstraininnudemiceacelllineof transplantable hepatocellular in the thenconductthe researchofthem rabbitsofsame rabbits，and transplanting among species，and