一种新的D1201紫膜蛋白的初步表征.pdf

维普资讯 讲 学血 扳 第 4】卷 第 2期 CHINESE SCIENCE BULLETIN 1996年 1月 l1c一种新的D12Ol紫膜蛋白的初步表征 n 胡坤生 张衡涛 张 克 谈曼琪 田新玉。周培瑾 __--—_’一 。—’—’}’-- ’_-··，’。一 (中国科学院生物物理研究所 ．北京 100101) (中国科学院微生物研究所，北京 100080) 关键词堂 。-加- 瞧 生苛 荚 蛋臼 自从 7O年代初Stoeckenius等人发现紫膜细菌视紫红质 (BR)以来，对 BR结构、功 能 及其在分子 电子学中的应用 已成为生物膜研究中的热点lu．尽管 自80年代后期 以来，基因工 程在分子生物学 中的应用极大地推动 了我们对 BR质子泵功能的认识 ．但到 目前为止 ，BR详 细 的质子泵机理仍是争论 的焦点．生物物理所与微生物所合作，从青海省大柴旦盐湖底泥 中 分离并纯化一种新的嗜盐菌菌株 DI201．这一菌株能在光照下形成紫膜 ，与通常紫膜不 同的 是 ，明适应最大吸收值为 550nln而不是 568nm 对其结构与功 能的研究具有重要 的生物学 意义 ，同时也有助于我们对 BR结构与功能进一步 的了解 ． 1 材料与方法 菌株 的培养 将筛选好 的D1201纯菌株接种到 l0omL培养基 中，细菌培养基 为蛋 白胨培 养基．1030mL培养基中包含：蛋 白胨 L3710．0g NaCI250g，MgSq ·7H々O 20g，CaCI2 026g，柠檬酸三钠 5．0g．KCI2．0g，在 3TC恒温箱 中培养 7d后 ，离心收集菌体 ，然后用 25％ NaCI溶液洗涤两次，菌体悬浮于 Naa 溶液 中，加入少量的DNAase，在 4℃冰箱 中对蒸馏水透 析过夜 ．10000 离心 10min除去沉淀物 ．上清 液在 4℃，50000 离心 40min，反复操作 4～5次以除去红膜，得到紫膜粗制品．分离得到的紫膜用线性蔗糖密度梯度法离心分离 (蔗 糖的浓度范围为 l5％～45％)，4℃，200030g离心6h．紫膜悬浮在 35％～37％蔗糖浓度层上 ． SDS凝胶 电泳按常规方法进行 ．5rag紫膜在 1％ 的 SDS溶液 中煮沸 5min，约 l0 g紫膜被加样到 15％ 的聚丙烯酰胺胶板上进行恒压 电泳约4h，蛋白带用考马 氏亮兰R-250 法进行染色检测 ． 紫膜囊泡的制备方法按文献[21，紫膜囊泡悬浮在基础盐溶液 中，光诱导溶液 pH 改变用 贝 克曼 71-4~pH酸度计测定 ．吸收光谱用 Perker-ElmerLalnda一17型分光光度计测定 ．闪光光 解实验在美国加州大学 旧金 山分校 W．Stoeckenius实验室完成 ． 2 结果与讨论 Z1 D1201的生化和形态特征 嗜盐菌菌株 D1201生长在极端高盐浓度环境中，低于 12~／,NaC1浓度时不能生 长，菌呈 】995—02—06收稿 ，i995—06—05收修 改稿 ·中国科 学 院重太项 17资金 资助项 日 维普资讯 第 2期 科 学 通 报 175 杆状 ，直径约 1 长 3m 左右，对抗菌素不敏感 ，膜脂为甘油二 乙醚衍生物 ．G+C含量 6．97oto1％．从这些特征 中我们可以看到菌株 D1201属于古细菌类 ． 2．2 分子量测量 D1201紫膜 的SDSd：~AGE电泳 图表 明，它与正常紫膜一样 ．它只含有一种 蛋 白，我们称 之为 D1201紫膜蛋白，此蛋 白比正常菌紫质 的分子量要小 ，分子量为 20ku． 2．3 吸收和圆二色谱测量 图 l是 D1201紫膜悬浮液 的吸收光 谱 ．正常菌紫质 的吸收最大值为 568