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一、色谱法的分离原理 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。高速-流速为0.1~10.0 ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备 。 三、色谱法分类 ??? 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。 气相色谱法适用于分离挥发性化合物。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。 四、色谱分离原理 ??? 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 2．定性参数（保留值） 死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，VM）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有VM参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） 保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR 调整保留时间(adjusted retention time，tR)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因此，tR（或tR）可用于定性。tR＝tR－t0 调整保留体积(adjusted retention volume，VR)--扣除死体积后的保留体积。 3．柱效参数 理论塔板数(theoretical plate n