新城疫病毒F基因疫苗与鸡IL18基因联合免疫的探讨研究.pdfVIP

摘 要 本研究的目的是探讨NDVF基因DNA疫苗与鸡IL-18基因联合免疫鸡 体的效果及意义。 NDV北京株 (孔函)F基因扩增、克隆与序列分析。参考GenBank中 已发表的NDVF基因序列，设计、合成一对含有BarnHI和HindIII酶切位 点以及ATG起始密码子的引物，通过RT-PCR扩增出NDV北京株 凡〔担，) 的F基因，克隆到pGEM-TEasy载体中。经PCR鉴定和酶切鉴定的阳性 重组质粒pGEM-F，经序列测定并与GenBank中NDVF基因进行序列比较 和分析，结果表明凡声，株与NDV国内流行株同源性高达93%以上，与国 外流行株同源性则达89%以上，表明F48E，株具有代表性。 F基因真核表达质粒pcDNA一的构建与瞬时表达。将F片段克隆到真 核表达载体pcDNA-3.1中，得到重组质粒pcDNA-F.pcDNA-F在脂质体介 导下转染Vero细胞，通过间接免疫荧光试验检测，结果表明F基因在Vero 细胞中成功进行了瞬时表达。 pcDNA-F与pcDNAcIL-18联合免疫试验。将14d龄鸡随机分为4组， 每组10只。第I组:pcDNA-F十pcDNA-cIL-18免疫组:第II组:pcDNA-F 免疫组:第III组:传统疫苗免疫组;第IV组:非免疫对照组。分别于 14d 龄、28d龄进行一免和二免。分别于14,21,28,35,42d龄，心脏采血， 分离血清及淋巴细胞。分别用ELISA检测测定其抗体水平，以淋巴细胞转 化试验 (MTT)方法检测T细胞转化水平。并于43d龄用50LD二的NDV 强毒株进行攻毒保护试验。结果显示，pcDNA-F十pcDNA-cIL-18免疫组T 细胞转化水平明显高于pcDNA一免疫组和传统疫苗免疫组((P0.05)。而 pcDNA-F+pcDNA-cIL-18免疫组与pcDNA一免疫组均检测出NDV的抗体， 但两组的抗体水平差异不大 ((P0.05)。攻毒试验结果是:非免疫对照组 10/10死亡，常规疫苗组10/10保护，pcDNA-F+pcDNAcIL-18免疫组5/10 保护，pcDNA一免疫组3/10保护。 本试验综合表明将真核表达质粒pcDNA一接种小鸡，可诱导细胞免疫 和体液免疫应答，对致死量 F.强毒攻击可提供 3/10免疫保护。 pcDNA-IL18与pcDNA-F联合免疫小鸡，机体细胞免疫应答明显增强，免 疫保护效果比pcDNA-F免疫也有提高。再一次证实了鸡IL-18的免疫增强 作用，尽管其免疫保护效果未能达到常规疫苗的效果，但提示具有深入研 究、提高的诱人前景。 关键词:新城疫病毒 F基因 IL-18 基因疫苗 本论文常用英文缩写词 Amp a帅icillin 氨爷青霉素 AM、 Bra- avianmyeloblastosisvirusreversetranscript- 禽成翻细胞瘤病毒反转录酶 bp basepair 孩基对 BSA bovineserumalbumin 小牛血清白蛋白 cDNA complementarydeoxyribonucleicacid 互补DNA CTL cytotoxicTlympocyte 细胞毒性T细胞 d day 天 DEPC diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酸 DNA Deoxyribonucleicacid DNA dNTP. 2-Deoxyribonucleoside5-triphosphate 脱氧核格核昔三礴酸 E.B ethidiumbromide 澳化乙淀 EDTA ethylenediaminetetraaceticacid 乙二胺四乙酸 g gram