Ecoli+O157H7的分离鉴定及其五重PCR检测方法的研讨.pdfVIP

摘 要 为了了解广东省大肠杆菌0,57:117(Escherichiacoli0157:H7,E.coli0157:H7)在猪 粪便、牛粪便、屠宰场和市场肉制品的存在情况，自2002年8月至2003年8月从广州、 深圳、东莞、韶关和南海等地采集猪肉样品250份、猪粪便318份和牛粪便206份共774 份样品，将样品放入新生霉素改良肠道杆菌增菌肉汤培养基中增菌 18-24h，再将增菌液 涂布于改良的IL1梨醇麦康凯 (SorbitolMacConkeyAgar,CT-SMAC)培养基上进行 E.coli0157:H:的分离，经血凝试验、生化鉴定以及聚合酶链式反应 ((PolymeriseChain Reaction，PCR)鉴定，从这些样品中分离出4株E.coli0157:H7。其中从猪粪中检出3 株E.coli0,5,:H7，猪粪样品的检出率为0.94%(分别命名为03048,03511和03512):牛 粪中检出1株 (命名为021210)，牛粪样品的检出率为0.48%。农贸市场的猪、牛肉样品 及从各屠场采集的猪肉样品未检测到E.coli0,57:H7oE.coli0157:H7总的分离率为0.52%0 将分离菌株腹腔注射小白鼠进行毒力试验，结果各菌株毒力表现不同:菌株021210 的死亡率为5/5,菌株03512的死亡率为4/5，菌株03048的死亡率为1/5，菌株03511的 死亡率为015.PCR鉴定结果表明:菌株021210含有eae,sit-I和slt-II三种毒力基因， 而菌株03048,03511和03512都只含有，It-I一种毒力基因。毒力基因多少与小鼠死亡率 具有一定的相关性。 对4株E.coli0,57:H7菌进行26种药物敏感性试验，结果表明各菌株都有比较强的耐 药性，对青霉素G,氨节青霉素、万古霉素、苯哇青霉素、红霉素、四环素和强力霉素耐 药率均达100%;而对吠喃妥因、氧呱啧青霉素、复方新诺明、先锋V、甲氧节氨嗜睫、氯 霉素、痢特灵、环丙沙星、头抱吠肪、庆大霉素、卡那霉素、复方新诺明和氟呢酸则表现 耐药率高低不同:对先锋唾肪、菌必治、头抱拉定、链霉素、丁胺卡那、菌必治、复达欣、 先锋必和妥布霉素全部敏感。 本文应用多重PCR技术从食品和粪便中快速检测EcoliOls7:H7进行了研究。根据已 发表的E.coli0157:H:的rfbE基因、flit基因、eae基因、slt-I基因和sit-II基因分别自行 设计了五对引物。 利用设计的五对引物，通过对PCR反应的各引物浓度、M犷+浓度、dNTP的浓度、退 火温度和时间和循环次数的摸索，建立了五重PCR检测E.coliOt57:H7的方法。该方法能 扩增出5个大小不一的DNA片段，分别为802bp的flit基因片段、582bp的rfbE基因K 段、487bp的slt一基因片段、368by的eae基因片段和177bp的slt-I基因片段。 本文采用克隆与测序的方法对五重PCR产物进行鉴定。将PCR产物回收、连接到 pMD18-T载体、再转化到DH5a工程菌中，挑取阳性菌落进行PCR鉴定、质粒的回收与 鉴定后进行测序，测序结果经分析表明，5条带都是目的片段的基因序列且人小与预期的 相符。经测序证明扩增产物为目的基因片段。 用建立的五重PCR对5株E.coli0157:147菌株和27株非E.coli0,57:H:菌株进行扩增， 结果5重PCR只能从E.coli0157:H7检测出582bp的rfbE基因，而其它菌株为阴性;5重 PCR能从E.coli0157:H7检测出802bp的flic基因，除E.coli01:H7外，其它菌株为阴性; 5重PCR能从Ecoli0157=147检AID出eae(386bp),slt-1(177bp)和slt-11(487bp)这三段基因， 而其它菌株为阴性(除014，含有slt-II外)。实验证明该五重PCR能够将E.coli0,57:H，与其 它的细菌区分开且能够检测出毒力的携带情况。 将标准E.coli0157:H7菌株882364纯培养液做10倍系列稀释，从每个稀释度取1pL 菌液进行五重PCR的敏感性检测，结果表明此PCR体系中含60个E.coli0,57:H7细菌时 仍能检测出来。五重PCR重复性检测结果表明:该体系能够较为稳定和重复的检测出Ecoli 0157:H7o 为了用五重PCR检测粪便样品中E.coli0157:H7，本文对含有系列稀释度的Ecoli0157: