荧光激活细胞分选在干细胞领域的应用.doc

1……. 荧光激活细胞分选在干细胞领域的应用 2…….细胞分析术最新文献及动态摘要 荧光激活细胞分选在干细胞领域的应用 摘要：在干细胞研究领域应用的荧光激活细胞分选（FACS）已经成为一种高纯度识别、分离稀有细胞群体的专项技术。这种技术一直处于稳定的发展过程中，但是干细胞表型的多变性一直是此项技术的最大挑战，而且还存在很多技术难题。但是，FACS仍是目前识别、定义稀有细胞的最佳选择，尤其是在干细胞领域。 关键词：FACS，流式细胞仪，细胞分选，干细胞，神经干细胞，祖细胞，血细胞生成素，神经细胞毒 介绍：对干细胞的研究工作仍在不断进行当中。干细胞最初是在研究受辐照小鼠骨髓再生过程中发现的。细胞培养实验中也部分地描述过一类细胞，但对干细胞研究真正的进展是在使用了荧光激活细胞分选技术之后。此项技术综合运用了细胞的物理学、新陈代谢和细胞表面等特征来识别干细胞。 在干细胞研究中， 我们关注的重点在于干细胞分化过程中出现的一系列表面蛋白和其他细胞特征所发生的有序变化。据此设计出了通用检测方法：即通过“已分化”特征来去除非干细胞群体，并最终通过“原始”特征来选择干细胞群体。同时由这个方法也定义出了多种不同的干细胞表面标志物，如系别抗原阴性、c-Kit+、Scal-1+、CD34+和rhodaminelo Hoechstlo。还有其他许多表面分子也被认为可用于识别干细胞。除上述一些指标外，还有是否表达CD133、endoglin、蛋白激酶C受体、各种骨架受体和CXCR4也被用于识别干细胞。在表1中我们总结了用于识别不同干细胞群体所需的流式细胞仪检测指标。 对于干/祖细胞系统结构还有另一种观点，解决了对于部分干细胞基础属性的一些困惑。这个理论假设干细胞系统不是呈等级分化的，而是一个呈细胞周期循环的连续变化过程。在后种模式下，干细胞表型在周期循环中呈可逆性的变化。 无论运用何种模式，流式细胞仪细胞分选仍将为不同实验条件下的干细胞基础研 究提供最严谨的信息，并提供选择性分离这些细胞作进一步研究的方法。 细胞分选历史 已有四十多年历史的空气喷射型细胞分选已成为在细胞水平阐述生命机制的生物学有力研究工具。1965年Mack Fulwyler是首位成功运用Richard Sweet喷墨打印原理来进行细胞分选的科学家。随即他们在Coulter volumes仪器进行了简单的外周血白细胞分选实验。此后，Stanford大学的Leonard Herzenberg与Sweet等人合作运用荧光技术进一步发展了细胞分选技术，发明了我们所熟知的荧光激活细胞分选。 八十年代出现的单克隆抗体技术为分选技术领域带来的繁荣，因为细胞上越来越多的分子可被荧光抗体所追踪并据此将这些细胞从混合物中分选出来。然而干细胞因为其在细胞群体数量稀少，只能通过FACS或相关技术进行分离。 在上世纪九十年代，对细胞分选的科学研究和商业市场需求已达到一定规模，第一台商业化高速分选型流式细胞仪上市了。这种具有多参数分析能力、分析速度达40,000-70,000/秒的新一代仪器使得高纯度分选含量低于0.1%细胞群体成为了可能。  表一：定义及选择造血干细胞的特征参数 物理参数 细胞密度 可塑性黏附 前向散射 侧向散射 代谢状态 染料外排 染料溢出 细胞周期(DNA定量) 细胞表型 Lineage negative Sca-1 c-kit CD34 CD133 ALDH 目前，基础领域研究中，出于对细胞高通量分析的特性需求，要将目标细胞分选出来供其他细胞学实验使用。但细胞分选在移植和其他体内研究仍是未能使用，因为我们还不能精确定义“什么是干细胞”，故对于现在学者来说需要从这些有限的细胞群体上获取更多的信息来了解它们。尽管现在的技术水平制造这些仪器还有困难，但这个学科资深学者已制造出了可同时检测17色荧光的仪器了。 Fig1:细胞分选仪的工作原理 将待分选的细胞加载到仪器上并给样本管加压。（A）细胞受压后经过样本管进行分选喷嘴。（B）鞘液以较低的压力也被输送到喷嘴。（C）喷嘴的形状使进入的鞘液形成层流。（D）受力鞘液流出喷嘴后保持层流，其液流中心为空。细胞通过细针被注入喷嘴的中心，并在喷嘴有未稍与鞘液合流。（E）此时细胞已被注入鞘液的中空区域。分选液流继续流向激光检测点。（F）当细胞流经激光光束时，它们将散射激光（前向散射光和侧向散射光）。激光还将同时激发任何标记在细胞上的染料和荧光探针。（G）所有的以上信息都将被光学系统收集，（H）光信号被转化为电子信号交将为专门软件所分析，并决定细胞是否被分选。 位于分选喷嘴顶部的压电式晶片将已固定的频率进行震荡