抗鸡传染性贫血VP3蛋白单克隆抗体的制备研究.pdfVIP

鸡白血病、传染性贫血 抗鸡传染性贫血VP3蛋白单克隆抗体的制备‘ 陆桂丽1’2，高玉龙1，高宏雷1，冉多良2，王笑梅1# (1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001； 2．新疆农业大学动物医学院，乌鲁木齐830052) infectious 鸡传染性贫血(Chicken anemia，1．1．2试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT infectious CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus，CIAV)引起，以再生障碍性贫血和全 身淋巴组织萎缩为主要特征的一种免疫抑制疾病。 基购自Invitrogen公司。 CIAV属圆环病毒科，圆环病毒属，基因组全长2．1-2方法 1．2．1 3kb左右，有3个部分或完全重叠的开放阅读框，分 VP3蛋白纯化抗原的制备：原核表达的鸡传 kDa)，VP2(24kDa)和VP3(13． 别编码VPl(51．6 6kDa)三种蛋白[1．21。VPl为病毒的唯一衣壳蛋白，化，收集各个梯度咪唑浓度液体，SDS—PAGE分析 也是主要的免疫原蛋白，与VP2蛋白共同作用可诱 其纯度，紫外分光光度计测定蛋白含量。 1．2．2动物免疫：首免，将纯化的VP3蛋白与弗氏 导产生较高的中和抗体；VP2为CIAV的非结构蛋 白，可能作为一个分子伴侣参与病毒VPl空间构象 完全佐剂等体积混匀，腹腔注射7周龄BALB／c雌 的形成，最近发现VP2具有蛋白磷酸酶活性[3]，但性小鼠，0．2mL／只(O．1mg／mL)；用弗氏不完全佐 其在病毒感染中具体生物学功能尚不清楚；VP3是 剂乳化抗原，分别在第14、28d进行二免和三免，免 功能蛋白，和VP2的开放阅读框互相重叠，其编码 疫途径和剂量同首免；第42d通过鼠腹腔和尾静脉 基因全长366bp，在各毒株之间同源性较高(内各注射0．1mL蛋白；第45d无菌取脾进行融合。 95％)[4]。VP3是CIAV的致病因子，是病毒复制必1．2．3间接ELISA检测方法的建立：按常规间接 需蛋白[7】。VP3又称为细胞凋亡素(apoptin)，它是ELISA操作步骤[5]，采用方阵法确定抗原最佳包被 一种很强的凋亡诱导剂，能诱导鸡胸腺细胞、成淋巴 浓度、待检抗体的最佳工作浓度及判定标准滞乏据阳 样细胞系、多种人恶性成淋巴样细胞系和人骨髓瘤 性血清孔的oD值接近1．0，阴性血清oD值0．2， 细胞的凋亡，所以VP3作为一种潜在的抗肿瘤侯选 P／N2．1为阳性。 药物，在恶性肿瘤细胞的控制治疗中也具有研究价 1．2．4细胞融合和单克隆抗体的筛选：按参考文献 值。 的方法[6]，制备小鼠的免疫脾细胞和SP2／0细胞， 本试验在获得CIAVVP3蛋白的基础上，通过 淋巴细胞杂交瘤技术制备了三株高效价的单克隆抗 6min，弃上清，充分振荡使两种细胞混合均匀，在 mL 体，均具有良好的特异性，为进一步研究VP3的生 50s内，37℃水浴条件下缓慢滴加l50％的 物学特性及CIAV监测、诊断方法打下了基础。 PEG溶液，滴加过程中不断的轻轻摇动融合管，然 后由慢到快逐滴加入37℃预热的基础培养液30 1材料和方法 mL，终止融合，将融合的细胞悬液室温下700 rpm／ 1．