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Southern_Blot分析课件
琼脂糖浓度 迁移率与浓度成反比 琼脂糖含量％（W/V） 线性DNA分离范围（Kb） 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 – 3 2.0 0.1 – 2 DNA的检测 用溴乙锭染色 在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 分 析 通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。 * DNA电泳 原理：带负电荷的DNA分子在电场中向正极泳动的现象。 因所带的电荷、分子量不同，泳动速率不同， 可作为分离DNA的方法之一。 侧视图 俯视图 marker lane 1 lane 2 （—） （+） 方法： 制胶 0.8%琼脂糖凝胶 ( 0.8g琼脂糖粉 + 100ml TAE ) * 均匀加热 * 加EB ( 60℃ ) * 去气泡 * 冷却拔梳子 电泳 * 2 ~ 5 V/cm * 注意正、负极 DNA转移 原理：利用毛细管虹吸作用，将分离的DNA片段 从琼脂糖凝胶中转移至固体支持膜上。 方法： 准备材料 搭置装置 凝胶处理 凝胶处理： 酸处理 碱处理 盐处理 0.25mol / L HCl 0. 5mol / L NaOH 1. 5mol / L NaCl 1mol / L Tris-Cl ( pH7.4 ) 1. 5mol / L NaCl 时间 作用 处理 溶液 10min 20min 20min 脱嘌呤 变性 中和 准备材料： 尼龙膜、滤纸、吸水纸 * 大小与胶等同 * 平衡于20×SSC 搭置装置： * 逐层赶气泡 * 叠放顺序 * 避免短路 吸水纸 滤纸 尼龙膜 凝胶 盐桥 转移方向 20×SSC 装置图 500g 引物标记 标记法：随机引物法 标记物：地高辛 ( DIG – dUTP ) ATCG (46 = 4096) 5` 3` 5` 3` 引物六聚体 5` 5` 变性 *
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