〔国科会计画执行成果报告〕.PDFVIP

〔國科會計畫執行成果報告〕 肝硬化的嚴重度與肝組織間質金屬性蛋白分解酵素的關係 （92.08.01-93.07.31 ） NSC 92-2314-B-002-168 執行單位 ：台大醫學院醫學系 內科 主持人 ：楊培銘教授（台大醫學院醫學系內科） 1 肝臟纖維化及硬化常被認為是不可能回復的，大部分肝硬化的患者會逐漸 有功能代償失調之現象，甚至出現一些併發症，如：食道靜脈曲張 、腹水 ，最後 可能發生肝衰竭。 已有不少的動物實驗及少數的人體報告顯示肝臟纖維化是可回復的 。臨床 研究證實，Ｃ型肝炎患者在接受干擾素治療後肝臟纖維化獲得改善。 臨床醫師的經驗常認為早期的硬化是可逆的，然而晚期的硬化則不可逆。 但是此經驗缺乏適當的理由。另外也有研究者認為在纖維化過程中有一個「不回 頭點」，但是此認知亦缺乏適當的描述。 間質金屬性蛋白分解酵素 （Matrix metalloproteinase, MMPs ）是一群可分解細胞 外間質的酵素，動物實驗顯示它們對肝纖維化的回復具有絕對的重要性，更有研究 顯示在初期的肝傷害導致纖維化時，間質金屬性蛋白分解酵素的合成增加，但是當 纖維化越來越厲害時，其生成則逐漸減少。我們初步的動物研究亦顯示形成時間越 久的肝纖維化越不容易回復，而且此不回復性與間質金屬性蛋白分解酵素的生成減 少成正比。此外，我們也以四氯化碳來造成肝臟的損傷，經過四週到十六週四氯化 碳的注射，MMP-2 和 MMP-9 的表現也逐漸降低，這些結果顯示，間質金屬蛋白分 解酵素的表現降低，亦降低了肝臟纖維化回復的能力。此結果說明在纖維化形成過 程的肝臟中，間質金屬性蛋白分解酵素的表現也許是一個代表此纖維化過程的持久 性及可逆性的良好指標。 本計畫就是要用病人的肝組織來證明這個假說。這個結果將能增加我們對肝纖 維化致病原理更深的了解，並希望能對激發出新的治療方法來促進肝硬化的回復上 有所幫助 。 2 實驗材料及方法 Materials 我們收集了30個因肝細胞癌或轉移性肝癌而開刀的病人之肝組織 （non-tumor part ），並立即將其保存在液態氮中 ，至開始做實驗時才取出。 RT-PCR 取大小約40 mg之肝組織homogenized 後，以Trizol將RNA萃取出來，並進行 1% agarose gel electrophoresis確定RNA品質。接著以合成之primers (table 2) ，進 行RT-PCR (invitrogen, SuperScript III one-step RT-PCR kit) ，以47℃ for 20 min 、 94℃ for 2 分，1 cycle 以及 94℃ for 45 秒、60℃ for 45”and 72℃ for 90秒的條 件，進行35 cycles 。 One-step RT-PCR 1. Take 40 mg liver tissue with Trizol (invitrogen) 1 ml, homogenized. 2. Repetitive pipetting 3. 0.2 ml chloroform (no additive)/1 ml reagent 4. Shake by hand 15”, stand 2-3 min., RT 5. Centrifuge 12,000 rpm 15 min, 4℃ 6. Repeat steps 2-5 7. Transfer aqueous phase (supernatant of up layer) to a new vial 8. 0.5 ml isopropanol/1 ml reagent, stand 10 min., RT 9. Centrifuge 12,000 rpm, 10 min., 4℃ 10. Discard supernatant 11. Add 1 ml 75% EtOH, wash pellet 1X 12. Vortex 13. Centrifuge 7,500 g 5 min., 4℃ 14. Discard EtOH 15. Dry pellet by speed Vac around 10