基因治疗原理与研究进展.ppt

三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。 比如： 肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境； 炎症组织特殊微环境等。 四、治疗基因的诱导表达 为了防止其表达不再受外界控制，所以有必要开发和完善一些可诱导性基因表达系统。 这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它与DNA结合的活性受某种诱导药物控制；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。 四环素抗性操纵子系统原理 四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。 无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达。 四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。 Tet-Off 系统中，Tet控制的转录活化子（tTA）是野生型Tet阻遏蛋白（TetR）与一活化蛋白（AD）的融合体。 Tet-On 系统中，TetR中四个氨基酸变化使其结合特性变为反向（rTetR)。在Dox存在时与TRE结合。 第五节 基因治疗的应用研究 1．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5．莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 6．家族性高胆固醇血症 7．囊性纤维化病 一、遗传病的基因治疗研究 第一例基因治疗 －腺苷脱氨酶缺乏症 生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。 病理：腺苷脱氨酶缺乏－脱氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。 治疗基础 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂 1983年腺苷脱氨酶基因被克隆 应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞 新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达 逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 包装好的假病毒颗粒易于分离制备。 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 3.逆转录病毒载体的特点 4. 逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。 （二）腺病毒(adenovirus，AV)载体 （二）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒的优点 1.基因导入效率高； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。 腺病毒载体缺点 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。 4.靶向性差。 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因表达时间相对较短。 * （三）腺病毒相关病毒载体 (adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 AAV Virus Particles Structure of AAV Virus Genomic DNA REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因 ITR：反向末端重复序列 ITR ITR AAV的特点 ● 以潜伏感染为主； ● AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。 AAV载体的缺陷： 常用基因治疗载体 ? 整合特点 安全性 感染细胞 克隆容量 逆转录病毒载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 7kb 腺病毒载体