代谢控制育种.pptVIP

一般地说，抗阻遏突变结果使胞内的酶有可能成倍地增长，而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。从作用效果上讲，二者都造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为“抗反馈调节突变型”。 （一）回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选 1．初级代谢途径障碍性回复突变型 根据“原养型→营缺型→原养型”选育途径进行。原养型菌株经过诱变剂处理后，使代谢途径中有关酶合成阻断，成为营养缺陷型菌株。然后该菌株再经诱变，使其发生第二次突变，突变可能发生二种情况：一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶活力，另一种在原突变位点以外位置回复突变，这时也可以使缺陷型的酶活力恢复，抗反馈调节突变株的筛选正是利用了后一个原理。 第二种回复突变体，其表型虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因的恢复，而是反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成。突变后的调节中心与活性中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由于调节位点已发生突变，它不能再和阻遏物结合，因此，回复突变解除了反馈调节机制，使有效代谢产物大量累积。 腺核苷酸(AMP)和鸟核苷酸(GMP)的合成通过一个共同前体次黄嘌呤核苷酸(IMP)，其中次黄嘌呤脱氢酶受GMP反馈抑制。从谷氨酸棒状杆菌中筛选到一株腺苷酸缺陷型(ade-)由于③处阻断，所以能累积肌苷酸，但不能累积鸟苷酸，因为②处次黄嘌吟脱氢酶受GMP反馈抑制。如果筛选腺苷酸和黄瞟呤核苷酸的双重缺陷型(ade-、xan-)，由于②③处合成酶都被阻断，于是肌苷酸累积得更多。该菌株若进一步再诱变，可以得到一个黄嘌呤回复突变株(ade－、xan＋)，使②处代谢流疏通，它既能累积IMP，也能产生GMP。这一现象可以解释为次黄嘌呤脱氢酶的结构基因突变使酶的调节位点结构改变而失去和终产物结合的能力，具有抗反馈调节的特性，活性中心正常地和底物结合，恢复了催化位点的功能，GMP大量地累积。 如将诱变孢子悬液涂布在甘油作惟一碳源的平板上，培养后长出菌落。然后在菌落上喷上O-硝基苯酚－β-D半乳糖苷(ONPG)，组成型成黄色，诱导型呈白色。这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生β-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑选。此方法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。 3．鉴别性培养基的利用 4．筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例如利用苯-β-半乳糖(PG)筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株。 二、抗分解调节突变株的选育 抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。在实际生产中，最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节(尤其在次级代谢)。 例如以甘油和铵盐培养产气杆菌时，能产生组氨酸，当采用葡萄糖代替甘油作碳源，则酶的合成受抑制。易迅速利用的碳源对次级代谢的影响也很大，特别对抗生素。 微生物次级代谢的特点，在菌体细胞旺盛生长期抗生素合成酶尚未形成，或者即使形成也处在被抑制状态，不能产生抗生素。待菌体生长期结束，培养基中某些营养物质特别是磷酸盐等基本耗尽时，才开始产生抗生素合成酶，然后产生抗生素等次级代谢产物。培养基中过多的糖、磷是合成抗生素关键酶的阻抑物。假若选育有关抗分解调节的突变株(如碳源分解调节、氮源分解调节、磷酸盐分解调节)，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。 易分解的碳源，如葡萄糖的中间产物，阻遇难于分解碳源的分解酶合成，其结果造成“二次生长”现象，在次级代谢生产中，例如在抗生素发酵中也经常出现。 微生物在抗生素生产过程中存在快速生长阶段和抗生素合成阶段。已经证实，高浓度的葡萄糖对青霉素转酰酶、链霉素转脒基酶和放线菌色素合成酶等抗生素产生的关键酶均具有分解阻遏作用。由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏了抗生素合成的关键酶，从而抑制了抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。 筛选方法与实例： (一)解除碳源调节突变株的选育 1．循环培养法 将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。 例如，将大肠杆菌先在葡萄糖培养基中培养，后又转移到乳糖等慢速利用的碳源培养基上培养，出现一个生长的延缓期，此时由于突变株解除了阻遏现象，在葡萄糖培养基上生长时已合成乳糖分解酶，故在含乳糖培养基上很快就能形成菌落，而野生型菌株转接到乳糖培养基中，需要花去一定时间去合成分解乳糖酶，其生成速度比突变株慢得多，控制培养时间，可以筛选到目的变株 假若筛选抗