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第二章 基因工程;1、什么是基因？如何分类？ 什么是基因表达？;1）经典的基因概念（Theory of the gene） 1926 T. H. Morgan;1、什么是基因？如何分类？ 什么是基因表达？;顺反子学说：一个顺反子就是一个基因，这个基因或者编码蛋白质，或者编码RNA分子。 在一个顺反子内，有若干个突变单位 突变子 在一个顺反子内，有若干个交换单位 交换子 顺反子学说彻底否定了基因是决定遗传性状的功能单位和突变、重组的最小单位这样三位一体的概念。;1、什么是基因？如何分类？ 什么是基因表达？; 基因可自体复制 1953年Watson-Crick 提出了DNA双螺旋结构模型。说明了半保留复制机制，两股DNA彼此分开，以每一股为模板，按碱基配对的规则，各自配上一股新的DNA，复制便告完成。; 基因决定性状 生物体的表（现）型（phenotype）是指有机体可见的或可计算的外在性质，而基因型（genotype）是指控制这些表型的遗传因子。; 基因突变 基因通常是一个稳定的遗传单位，但它也可能发生可遗传的变异，这种变异叫基因突变（mutation）。突变以后的基因以新的形式稳定遗传。携带突变基因的生物体叫突变体（mutant），携带正常基因的生物体叫野生型（wild type)。;;;2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的前景如何？;遗传工程：是包括基因工程在内的人工改造生物遗传性状的全部技术； DNA重组技术：是采用酶法，将不同来源 DNA进行体外切割与连接构成杂种DNA分子： 分子克隆：主要是指DNA分子在宿主细胞内的复制过程。 三者之间有联系，但是有不同。 ;;（3） 基因工程的成果和发展前景;A 基因工程与医药卫生;基因工程胰岛素（一）;基因工程胰岛素（二）;其它基因工程药物;B 基因工程与农牧业、食品工业;转鱼抗寒基因的番茄;转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯;不会引起过敏的转基因大豆;超级动物;特殊动物;C 基因工程与环境保护;基因工程与环境污染治理;A 重组DNA技术的理论基础;B 基因的分子生物学;C 基因工程的基本原理;D 基因工程的支撑技术;三 基因工程的基本条件;A 用于核酸操作的工具酶;（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶类。 1、限制酶：凡能识别和切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶类，全称是限制性核酸内切酶（1）、限制性核酸内切酶的发现：;限制性核酸内切酶的生物功能;（2）限制性核酸内切酶的命名;（3） 核酸限制性内切酶的类型 根据识别序列和切割位点的一致性，分为3类： 其中II型酶的核酸内切酶活性和甲基化作用是分开的，且具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用。;II 型限制性核酸内切酶的基本特性;EcoRI等产生的5‘粘性末端;PstI等产生的3‘粘性末端;PvuII等产生的平头末端;;2、DNA连接酶及T4-DNA连接酶;DNA连接酶(ligase):催化2条链3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键。 DNA连接酶的活性 能封闭nick，而非gap 反应温度：37℃为最佳温度 26℃反应4小时 4℃过夜 ; 3、DNA聚合酶：将脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’- OH末端，催化核苷酸的聚合。 （1） 大肠杆菌DNA聚合酶I(E. coli. DNA Pol I) 特点： 5’-3’DNA聚合酶活性：Mg2+、单链DNA模板、 3’- OH末端 3’-5’ 外切酶活性：识别消除不配对碱基 5’-3’外切酶活性 ;作用 DNA缺口转移;（2） 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段) 特点 5’-3’聚合酶 3’-5’外切酶 应用 用同位素标记DNA片段的末端 补平粘末端 合成cDNA第二链 Sanger双脱氧法进行序列测定 定位突变 ;B 用于基因克隆的载体;载体应具备的条件;在基因工程中，载体一般是用天然质粒或病毒为材料，经过人工改造或重新构建而成，改造的目标： 1、质粒改小(增加有效装载量和拷贝数) 2、减少相同的限制酶切点，使载体适合于多种限制性酶的切割 3、引入强的复制原点，构建克隆载体 4、引入强的启动子和其它表达序列，构建表达载体。 5、引入两种不同的复制原点，构建穿梭载体。;1、质粒载体（Plasmid