求出受试化合物对藻类生长抑制的ec50.ppt

藻类生长抑制实验 四、实验步骤 三、实验材料与方法 二、实验原理 一、实验目的与内容 主要内容 五、实验结果 六、注意事项 七、讨论与思考 实验目的与内容 一、实验目的 1. 了解藻类的生长规律； 2. 掌握藻类的培养方法； 3. 掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的 评价方法。 二、实验内容 1. 运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污 染物的水环境中的生长抑制情况； 2. 求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50； 3. 阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制 特征。 单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水平对水体中的初级生产者的作用情况。 通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在规定的实验条件下继续培养，每隔24 h测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或t检验，显著低于对照(P 0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。 实验原理 实验仪器与试剂 1. 受试物 研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过0.1 mL/L。 2. 藻种 斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。 3. 培养基 藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻可用“水生4号”培养基培养。 配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。 表1 水生4号小球藻和栅藻培养基 营养盐 含量(mg) 营养盐 含量(mL) (NH4)2SO4 0.200 FeCl3(1%) 0.015 Ca(H2PO4)2?H2O 0.030 土壤浸出液* 0.500 NaHCO3 0.100 水 1000 KCl 0.025 MgSO4?7H2O 0.080 *取少量菜园土，加2–3倍自来水，煮沸10余分钟，冷却后用滤纸 过滤即可使用。 4. 实验器材 电子天平(2台)、立式压力蒸汽灭菌器(2台)、无菌操作台(4台)、显微镜(4台)、生化培养箱(2台)、pH计(4套)、气浴恒温摇床(4台)、可见分光光度计(4台)、数字照度计(2台)、血球计(4套)、血小球记数板(200块)、4到7只30W的普通白色荧光灯、ф60漏斗(4个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。 5. 实验药品 硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁均为分析纯，土壤浸出液。 实验步骤 藻类培养 培养温度为：24±2 ℃；白色荧光灯均匀光照，光照强度为4000±400 lux，连续光照或以12：12或14：10光暗比光照；机械震荡(100±10次/min)；培养容器用棉塞、滤纸、纱布(2~3层)或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封闭。 可根据实验需要选择容量不同的实验容器，125 mL锥形瓶中测试液的体积为40-60 mL；250 mL锥形瓶中测试液体积为70-100 mL；500 mL锥形瓶中测试液的体积为100-150 mL。 2. 藻试液的配制 从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，接种浓度约为104个/mL。在与试验要求相同的条件下进行预培养，要求在2–3天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到新鲜的培养液中。如此反复转接培养2–3次，藻类生长健壮并开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验液。 3. 受试物试验液的配制 根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构成对数间距系列的浓度，浓度比不超过2.2。最低测定的浓度必须对海藻生长没有影响。最高测定浓度必须抑制相对对照实验至少50%的绿藻生长，最好使绿藻生长完全停止。至少设置3个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液的pH，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.5±0.2。试验结束时应