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（3）PCR引物设计 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 1 PCR的引物设计 PCR引物的使用 引物的在线设计工具及免费软件简介 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 选择合适的引物是PCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的 引物的长度 标准就是与靶序列的高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意 下列几点： 理想的引物长度应该在18-30个碱基之间，常见的是20-27个碱基 PCR引物的设计原则 引物的GC含量 引物序列中的GC含量应在35% - 65%之间，最好在45% - 55%范 围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高的GC碱基，那么就 在其5’端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其 5’ 端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。 PCR引物的设计原则 退火温度（Ta） 引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5℃左右，在很多 情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-6℃，尚 不至于影响RCR扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-75℃范围 引物碱基≤20，Ta = 4 X（G+C）+ 2 X（A+T）- 5（℃） 内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长较低Ta值的引 物的3’端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或5’端。 引物的Ta值估算有多种公式，最好根据RCR试剂盒建议的计算方 法，例如Alkami Quick Guide?试剂盒建议的计算方法如下： 引物碱基≥20，Ta = 62.5 + 0.41 X（GC%）- 500 / 长度 - 5（℃） PCR引物的设计原则 杜绝互补区域的存在 引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。 为扩增后操作提供便利条件 在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5’端引入诸如限 限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩 增后操作。 PCR引物的设计原则 引物与模板的互补程度 在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%互补，但 检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域 为了减少PCR扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模 板DNA上是否存在潜在的引物同源区域。 尽可能高的互补程度是必要的。 PCR引物的设计原则 选择内含子序列作为引物序列 在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含 引物的末端序列 在引物的两端设置1-2个嘌呤碱基，最好在引物的3’端避免G或C 这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物3’端 子序列也是随机多样性的。 至少应有1-2个碱基必须是特异性的。 中山大学药学院 引物实际设计 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100?l （1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同 3‘下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5————— 3 ——上游Primer ——下游Primer 负链 3————— 5 5 3 ＋ － 上游Primer 下游Primer 例如： IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG-----------CGATCTTTTGAGTCCAA 3 负链 3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3→5然后倒过来5→3 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 中山大学药学院 (3)ATG起始密码 5’- GGGAATTCATGGCTCCATGACCCAG-3’ (4)TAA、TAG、TGA终止密码 中山大学药学院 如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆 ∵未切开，连接不上 5-TTATTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 PCR引物的使用 PCR引物的标准使用范围：0.1 - 1.0 mM，最好0.2 - 0.5 mM 特异性的改进：降低引物和dNTP的浓度