第九章植物原生质体培养与体细胞杂交演示课件.pptVIP

（1）在原生质体培养中，加入2,4-D对于原生质体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈伤组织是很有效的，如禾谷类植物。 （2）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结合使用。 （3）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要求较高的生长素/分裂素配比才能进行分裂； 由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体，常需要较高的分裂素/生长素配比才能进行脱分化。 （四）氮源 许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。 NH4+浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂都有利。 还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产生毒害作用，因此使用时应特别注意其用量。 （五）复杂有机物 在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物，可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。 二、培养方法 原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养 （二）平板法培养 （三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法 原生质体培养一般采用液体培养 1、有些物种的原生质体不能在固体培养基上分裂。 2、采用液体培养有利于调整培养基成分。 3、采用液体培养可将经过几天高密度培养之后的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。 （一）液体浅层培养 1、方法 把原生质体以一定的密度（约2×105个/mL）悬浮在液体浅层培养基中（浅层的厚度以1mm为宜），用石蜡膜封住平皿后，放在适宜条件下培养。 2、优劣 优点是：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新鲜培养基。 缺点是：原生质体分布不均，易造成局部密度过高或原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育；难以实施定点观察和跟踪观察。 （二）平板法培养 1、方法 取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至45℃的含琼脂或琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器内。 2、优劣 ?有利于原生质体均匀分布； ?便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、分裂等行为； ?也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。 （三）悬滴法培养 1、方法 将适宜密度的原生质体悬浮液，用滴管或定量加液器，以50ul/100ul的小滴接种于培养皿盖内，其数量以滴与滴间不相碰为原则，皿底加入液体以保湿。将皿盖稳妥地盖在皿底上，封口培养。 2、优劣 优点是：所用材料较少，培养液用量也少；有利于通气和观察， 易添加培养基；不易污染等。适合低密度培养。 缺点是：原生质体分布不均，易集中于小滴中央；液滴与空气接触面大，培养基成分和物理特性易于变动。 （四）固液结合培养法 1、双层培养法 在培养皿底先铺一层固体培养基（含或不含原生质体/细胞），再在其上进行原生质体的液体浅层培养。 2、切块悬浮培养 先将原生质体包埋于固体平板，再将其切成小块，投入到大体积的液体培养基中，并放于摇床上进行振荡培养。 3、琼脂糖珠培养法 即将原生质体与琼脂糖培养基混合后，逐滴滴在培养皿底面，待其凝固后，再在其周围加入液体培养基。采用这种方法可以在液体培养基中加入经辐射处理的细胞。 三、培养密度 1、原生质体适宜的培养密度一般为1×104-1×105个/ml，但这不利于单细胞无性系的筛选。 2、低密度下培养原生质体，可通过改良培养基组成和改进培养方法入手。 （1）一般培养基成分越复杂越全面，原生质体的培养的植板密度就可以越低。 （2）改进培养方法也可有效降低培养密度。如饲喂细胞层法；不同类型的原生质体混合培养的方法等。 四、培养条件 （一）光照 1、新分离出的原生质体应在散射光或黑暗中培养。 2、在原生质体对光敏感的情况下，应尽量减少观察的次数，凡经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。 （二）温度 1、原生质体培养一般在25-30 ℃下进行。 2、较高的培养温度往往有利于启动和维持原生质体的分裂。 （三）湿度 在原生质体固体培养和小液滴培养中，应注意培养湿度的保持。 第四节 由原生质体再生植株 一、原生质体再生细胞壁，形成完整细胞。 二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织。 三、由愈伤组织分化形成植株。 一、原生质体再生细胞壁 原生质体在培养中能否再生细胞壁并进行持续的分裂是关系到原生质体培养成败的关键因素。 1、一般，原生质体再生细胞壁是其进行正常