第三章 免疫酶组织化学技术PPT.ppt

SABC法 原理： 一抗＋生物素化二抗＋SABC复合物 SABC复合物 链霉卵白素－生物素－过氧化物酶 生物素标记的二抗 链霉卵白素连接 生物素标记的酶。 优点：敏感性略高于SP法，低背景和操作简便 缺点：因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。 其它免疫组化方法----SABC 一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素)+辣根酶底物显色 SP法：一抗 + 生物素标记二抗 + 辣根酶标记链霉卵白素 + 辣根酶底物显色SABC法：一抗 + 生物素标记二抗 + 滴加试剂SABC（链霉卵白素 + 辣根酶标记生物素） + 辣根酶底物显色SABC为：链霉亲合素一生物素过氧化物酶复合物。ABC为：亲合素一生物素过氧化物酶复合物。(反应原理是一样的，只是应用的亲和素不同。) 原理： 将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体 优点： 1 简便、快速、敏感性是S-P/SABC法的几十倍。 2 由于人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰 缺点： 因大分子穿透核膜困难, 对于核内抗原的定位不能选用此法。 Envision法 其它免疫组化方法----Envision法 EnVision工作程序：1） 脱蜡、水化组织切片。2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）3） 蒸馏水漂洗，置于PBS中。4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）5） 蒸馏水漂洗，置于PBS，10分钟6） 一抗孵育10-30分钟7） PBS漂洗10分钟8） EnVisionTM孵育10-30分钟9） PBS漂洗10分钟10) 色源底物溶液孵育10分钟11) 蒸馏水漂洗12) 复染及封片 其它免疫组化方法---- CSA法（催化信号放大法） 原理： 是酪胺的过氧化物酶反应(即HRP催化酪胺盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原—抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素—HRP结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，其敏感性得到几何级放大。 优点： 比EnVision法敏感20～100倍。 适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法; 核内抗原的检测（原为杂交）。 缺点： 操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。 三、免疫酶组织化学染色操作中的注意事项 1 实验设计 列出实验目的; 所有抗体种类; 拟用方法; 选用病例的诊断及其切片(如系动物实验，则同样应有研究计划)，应逐一记于玻片上，可用编码或符号表示; 每一抗体均应配以阳性或阴性对照 2 湿盒孵育技术 将切片平放于湿盒中，滴加抗体. 切片较多，可分2～3组，以便流水作业，则可在一次试验内不停地完成大量工作,放入切片后加盖以防干燥，置37℃恒温箱内孵育。 3 抗原修复 定义：抗原修复是指恢复抗原原有的空间状态。 原理：组织经甲醛等固定后，形成醛键而封闭了抗原，或者被甲醛在蛋白质之间形成的交联结构所隐蔽，因此，在进行免疫组织化学染色时，需要破坏分子间的交联等结构修复或暴露被封闭或隐藏的抗原。抗原修复后可以重新释放抗原，从而增加染色强度。 方法：化学修复法、物理化学修复法 (1) 化学修复法 胰蛋白酶、胃蛋白酶、链酶蛋白酶等。 1) 0.1％胰蛋白酶液：孵育前将胰蛋白酶溶入氯化钙液内,混匀后,放入切 片,消化5-30’。 2) 0.4％胃蛋白酶液：溶于0.01 mol／L盐酸中,37℃消化5-30’。 3) 0.06％链霉蛋白酶液：溶于0.5mol／L的Tris缓冲液中,37℃消化5-30’。 (2)物理化学修复法 器具：微波炉、真空负压干燥箱、高压锅、电炉或水浴锅等 抗原修复液: TBS、PBS、重金属盐溶液等， 其中以0.0l mol／L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)最常用。 1)微波辐射抗原修复法 切片脱蜡至水 双蒸水洗 放到盛有枸橼酸盐缓冲液容器中 置微波炉内加热 92-98℃以上持续10-15 min 取出自然冷却 注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却。然后，经双蒸水、PBS洗，下接免疫组织化学步骤。 原理：该法利用微波24.5亿次／秒的高速运动产生瞬间热，微波辐射使各分子作极性运动，热使甲醛固定的蛋白质发生变性，在此双