[自然科学]基因工程-2章 分子克隆工具酶.pptVIP

第二章 分子克隆工具酶 核酸酶：通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶 工具酶：应用于基因工程的各种核酸酶 核糖核酸酶（RNase）：专门水解断裂RNA分子的酶。 脱氧核糖核酸酶（DNase）：特异性水解断裂DNA分子的酶 核酸外切酶（exonuclease）：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸的消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶（ endonuclease ）：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。 第二章 分子克隆工具酶 §1 限制性核酸内切酶 §2 其他分子克隆工具酶 早在五十年代初，两个研究小组几乎同时发现了两种不同来源的l噬菌体（lK和lB）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞（K株和B株），但当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，则感染频率普遍下降数千倍。一旦lK噬菌体在B株中感染成功，由B株繁殖出的lK后代在第二轮接种中便能象lB一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。这种现象称为宿主细胞的限制和修饰作用，它广泛存在于原核细菌中。 1960s，Linn和Arber在研究细胞限制性和修饰现象时在大肠杆菌中发现了限制性内切酶，人们才搞清了细菌限制和修饰作用的分子机制。大肠杆菌K株和B株都含有各自不同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制，其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断；hsdM的编码产物是DNA甲基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；而hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。大肠杆菌C株不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K株和B株中受到严格的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。 第一节 限制性核酸内切酶 一、寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断 ，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 二、限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease) 1.限制性核酸内切酶的概念 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。 2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 3.限制性核酸内切酶的分类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。 4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即回文结构。Ⅱ限制性核酸内