冷冻切片之原理与使用试验.PDF

冷凍切片之原理與使用 一、冷凍切片機原理與目的： 冷凍切片時利用低溫方式使組織結凍，因而增加組織之硬度，以提供切片時 所需之支撐性 ，因此冷凍切片機需經常維持於低溫操作環境。同時藉由低溫冷凍 方式，一方面可以縮短組織處理之流程與時間並可在不使用化學固定液處理的條 件下 ，得以保存細胞內生化活性或抗原性之完整，以提供並符合研究或臨床診斷 上特殊之要求與 需求。但以冷凍方式進行組織之切片，所需之儀器設備上較為昂 貴，且進行切片之人員須具備良好之技術 、訓練與經驗，方得以切出完整之薄片， 並避免在切片過程因低溫造成之傷害，而利用冷凍切片機所切出之組織切片中形 態保存上較傳統石臘切片為差，並常有扭曲及變形之發生。 二、冷凍切片機之構造： 冷凍切片機可分為兩大部分：由置於可控溫之低溫恆溫操作台內的 切片機主 體所構成。切片機之主體與石臘切片機類似，唯因處於低溫環境 故， 機件潤滑上 有別於常溫操作之石臘切片機，必須定期給予專用之低溫潤滑油 予以保養，以維 持機械零件間 之潤滑，不得使用普通或常溫之潤滑油，誤用時可能因凍結 而導致 機件損壞。同時操作時應配備適當之防護手套，一則防止手部觸及低溫機體而凍 傷，再則避免手部汗腺所蒸發之水氣進入機體，凝固後造成機件凍結或干擾機器 操作之精密度 。 冷凍切片機之恆溫操作台方面，平時應維持於 -5~-10 ℃之溫度，切片之前 再將溫度調至所欲切片組織之適當溫度﹝如附件一﹞，當操作時機體達到穩定之 低溫環境後再進行切片。 一般而言冷凍切片機每下降10℃約需1 小時的時間來 降溫 並穩定；當溫度低於-25℃以下時，則 恆溫操作台降溫所需時程會隨之增加 ， 每下降5℃約需1 小時。單溫型冷凍切片機極限溫度視壓縮機所使用冷煤而有所 差異，通常約在-30℃左右，進行切片時因視組織特性選擇合適之切片溫度，並 避免讓冷凍切片機處於極限溫度下操作 。為防止空氣中水氣之進入與凝結，操作 時 應盡量縮短打開操作窗之時間以維持穩定之低溫環境 。 如遇操作中因 突發事故而導致供電中斷，此時機體尚處於低溫狀態，一旦壓 縮機停止運轉而回溫，機體各處內將凝集大量之水滴。因 此雖獲再度供電，亦， 不得立即啟動冷凍壓縮機，以免所凝集之水滴凍結成冰，破壞機件。因此當冷凍 切片機停機後如欲再度啟動時，必須確認機體所含之水氣均予以完全排除後，方 可重新啟動冷凍壓縮機。目前大多數新式冷凍切片機 均有斷電回溫保護設計，當 斷電造成機體回溫達0℃以上時，重新供電後會自動進入乾燥程序，以加熱方式 蒸散在機體中所凝結之水氣，一般此程序建議維持至少72 小時以確保機件完全 乾燥，並將機體之排水孔打開以便凝結水之排除。在切片機處於加熱乾燥程序 時， 加熱會造成金屬機件的膨脹、並造成用以潤滑機件之低溫潤滑油揮發 、流失 與喪失潤滑功能，因此不應於切片機進入加熱乾燥程序時進行任何其他非必要操 作。當加熱乾燥程序完成後，重新啟動冷凍恆溫操作台 ，當機體達到一般維持溫 度 (-5~-10℃)後，重新以低溫潤滑油將相關機件進行潤滑保養，之後在調至所 需切片溫度進行操作。 三、冷凍切片之組織處理： 1. 固定： 冷凍切片之固定方式隨所研究之目的不同，而採用不同之固定方式，但大 體上還是 分為化學性固定與冷凍固定兩種。其中化學性固定必須考慮所使用之 固定液是否會干擾所欲研究標的構造之呈現，如其酵素之活性與表現、免疫反 應之抗原性等。因此，通常採用固定效果較低但對組織抗原性或生化活性保存 較佳之固定液，如低濃度福馬林等。避免使用如四氧化鋨 (osmium tetroxide) 或戊二醛 (glutraldehyde) 等固定效能高之固定液，以避免因固定藥劑之結 合，而破壞原本存在之組織抗原性。 冷凍固定法使用時可將新鮮取下之動物組織置於冷凍包埋劑中，直接投入 液態氮或經液態氮預先降溫之冷凍劑 (如 isopentane)中凍結。此種固定方法 對組織之生化活性保存最好，可保存組織之酵素之活性，提供酵素活性或免疫 分析。但切片後之保存需較嚴格之條件，以防止切片組織結構與活性之衰減。 2. 包埋： 冷凍切片時通常使用冷凍包埋劑 (OCT) 作為介質，提供組織適當之支撐 性。為避免因水份結凍時形成冰晶，造成組織塊之硬度不一與結構性破壞，而 妨礙切片之進行。因此在包埋之前，可 將已固定之組織塊逐次置入較高濃度之