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概述 关于本手册 本手册旨在介绍高分辨率双向（2-D）电泳的操作方法。 本手册共分七章： 第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。 第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程，重点介绍EttanTM IPGphorTM 3等电聚焦系 统。 第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相pH梯度（IPG）胶条的第二向电泳的一般方 法。 第四章介绍使用平板Multiphor TM Ⅱ电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。 第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。 第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE ）的优势与使用技术。 第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关 章节。 本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences公司的产品，该公司现为GE Healthcare公 司的一部分（下文均称GE Healthcare ）。备选设备及照片见表1。产品订购信息见第155页。 根据样本类型和研究性质的不同，本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。 双向电泳简介 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已 得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。 第一向步骤为等电聚焦（IEF ），即根据蛋白质的等电点（pI ）差异将蛋白质分离。第二向 步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相 对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。 因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等 信息。 双向电泳由OFarrel （1）在1975年首次建立。在最早的技术中，第一向分离使用的是含有 载体两性电解质的聚丙烯酰胺管胶，详见第43页2.1节。 自从双向电泳技术一产生，人们就认识到其作为一种生物化学分离技术的重要性，但这一 技术得到广泛的应用还应归功于以下几个方面的改进： 由于采用了固相pH梯度胶和Immobiline™试剂（2 ），使第一向等电聚焦的分辨率和可重复 性大大提高。基于这项技术，Görg及其同事们（3,4 ）开发出了目前所使用的双向电泳技术， 用固相pH 梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并用带支持膜凝胶代替了管胶。关 于此项技术的优越性详见第45页2.2节。 双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE ）首先由ünlü等（5 ）于1997年提出，这项技术可更好地 控制系统误差，使研究人员能够发现具有统计学意义的生物变异的蛋白质表达。 双向电泳后的一系列自动化操控，如凝胶图像分析、斑点采集、胶内酶解、以及靶样本制 备用于质谱测定等，大大增加了蛋白质分析与鉴定的能力。 新的质谱技术的发展，使人们能够快速鉴定和描述极微量的多肽和蛋白质。 现在的计算机和软件功能更强大，价格更低，可对高度复杂的双向电泳图像进行彻底的计 算机分析。 现在人们已经掌握了大量生物体全部基因组数据，从而可以迅速识别编码双向电泳分离的 蛋白质的基因。 目前蛋白质序列信息正日新月异地增加，并在公共域名数据库中共享，一些组织，如人类 蛋白质组组织（HUPO ），正在推动各国间的合作，共同进行蛋白质组学研究。 斑点图像数据库和基因组序列数据库均可以简单、直接地通过万维网访问，可分别用来比 对双向电泳结果和分析序列信息。 双向电泳技术在蛋白质组学领域里得到了大量的应用（6,7 ），利用该技术可对一种样本中 的许多蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量。双向电泳在这一领域中的应用也正是因为 其同时分离数千种蛋白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋 白质修饰，这是无法通过基因组序列分析进行预测的。双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分 析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白 质纯化等。本手册所介绍的双向电泳操作，采用 GE Healthcare 公司所生产的预制 IPG 胶条 （ 凝胶）。 Immobiline DryStrip 本手册中使用的符号