植物细胞及组织培养演示幻灯片.pptVIP

§4 - 2 花粉培养 一.花粉培养的意义 1. 花粉具有单倍体和单细胞两个方面的特点，是研 究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机理较为 理想的方法。 2.建立高效花粉粒培养实验系统，可为深入开展细 胞工程、遗传工程和发育分子生物学的研究提供技术 基础。 二. 花粉培养的一般方法 1. 花粉的分离 ● 挤压法：在一定浓度的蔗糖液或甘露醇液机械挤压花 药 去除花药残片 过网筛 收集离心(500～1000 r·min-1离心1～2min) 重复加悬浮液离心洗涤两次 用培养液离心纯化一次 纯化花粉粒； ▲此法操作简便易行，但花粉粒损伤较为严重，花粉中混 杂有体细胞，悬浮液中 花粉密度也不易控制。 ●磁拌法 将花药接种于盛有培养液和渗透压稳定剂的三角 瓶中放一磁棒（可增加几颗玻璃珠） 置于磁 力搅拌仪上低速搅拌花药呈透明； ▲此法分离花粉比较彻底，但对花粉有不同程度的 机械损伤。 将花粉经一定时间的低温处理 每毫升60～120枚花 药密度接种 在适宜的液体培养基上培养一定天数 花药自动裂开花 粉脱落在液体培养基中 合并收集花粉悬浮液离心（重复清洗二次：1000r- min -l, 1～2min） 用血球计数板计数（花粉密度达到每毫升 105个左右）。 ▲此法操作简便有效，可以连续收集花粉，对花粉粒无损 伤，但分离花粉欠充分。 ●漂浮释放法 2. 花粉的培养方法 (1) 直接培养法 从未经任何预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接 接种到培养基中进行培养。 关键技术：花药在水中分离花粉粒，并在水中培养5～7d，再 转到选择的诱导培养基上培养。花粉在水或无糖培养基中培养 时，比在含糖的培养基上存活力高。可能是无糖的逆境状况 （饥饿效应）促进了存活的离体花粉发育途径的改变。 (2) 花药预培分离培养法 将花药在基本培养基中培养3～6d，然后取出花 粉，经离心冲洗纯化后在液体诱导培养基（每毫升 104～105的密度）上进行培养。这一方法获得广泛 成功：曼陀罗、烟草、天仙子、马铃薯、颠茄、矮 牵牛、茄子、水稻、大麦、玉米和小麦等（1986， 1991，1989，1990，1989，1988，1990，1993） (3) 微室培养 将花粉粒接种在盖玻片或载玻片上特制的一个或数个微室 的培养基中进行培养。 (4) 条件化培养 在含有花药提取物的诱导培养基上接种花粉粒进行培养。 具体方法是，将花药接种在合适的培养基上培养一周，然后 取出浸入（每毫升水加入60枚花药）刚煮沸的水中，倒入研 钵内研磨，离心，其上清液就是花药提取物。提取物过滤灭 菌后加入培养基中。 (5) 哺育培养 以任何一种其胚状体或是愈伤组织的诱导频率必 须是比较高的花药（已在合适的培养基上培养裂开 的）作为一种哺育组织，将需要培养的花粉接种到 这种花药里进行培养的方法。 §4 -3 胚乳培养 一．胚乳离体培养的意义 被子植物的胚乳具有多倍性的特点： 2n， 3n， 5n， 9n； 原因：胚乳是双受精的产物，是由精细胞和极核 融合而成。但由于胚囊类型不同，参加融合的极核 数目不同，胚乳的倍性亦不同。如椒草型胚囊中有8 个极核，与精细胞融合后胚乳核为9n。 通常植物的胚乳细胞为3n ，利用这一特点培养 三倍西瓜、葡萄等无籽水果，是人们的希望所在。 到目前为止，约有30种被子植物的胚乳培养，达到 不同程度的细胞分裂和器官分化。有罗氏核实木、 大麦、水稻、苹果、袖橙、马铃薯、桃、荷叶芹等 七种植物形成了完整植株。 2. 胚乳培养的方法 (1)胚乳的剥离： 表面灭菌，无菌剥离；带胚培养胚乳组织容易成 功，不带胚培养胚乳组织成功率低。 (2) 胚乳发育时期 “游离核期” ：双受精后分裂形成的胚乳核； “胚乳细胞期”：游离核分裂形成许多小细胞。以 此期的胚乳为材料离体培养成功率较高。已在玉 米、柑橘、苹果、梨等培养中被证实。 ●传粉后胚乳开始进入细胞期的时间：因植物种 类而异：玉米在授粉后3～5d；梨(锦丰、早酥)20 d；黑麦草8～1O d；小 麦8 d；大麦8 d；黄 瓜 7～16 d 。 (3) 胚性因子的作用 ●胚性因子(Embryo factor)： 在诱导胚乳组织增殖,形成愈伤组织时,必须要有胚的存在。胚 对胚乳的增殖作用，有人称做“胚性因子”。 ●许多实验证明：赤霉素可以代替这种“胚性因子”。这一问题 仍需继续探讨。