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free template from 动物病毒学第3讲病毒的培养与鉴定 张德礼 西北农林科技大学动物科技学院 预防兽医学教研室 兽医微生物学与病毒学课程组 E-mail:zhangdeli@ delizhan delizhang@ 手机: 博客 5/dkxy/plus/view.php?aid=859 兽医微生物学 (多媒体教学课件) 任科教师：张德礼教授 (5/dkxy/plus/view.php?aid=859) 西北农林科技大学兽医微生物学课程组制作 2007/04/28 （7）病毒引起的细胞凋亡 * * 兽医微生物学 责任教授：张德礼博士 (5/dkxy/plus/view.php?aid=859) 兽医微生物学 第三讲 病毒的培养与鉴定 一、病毒培养载体类型 ?动物 ?鸡胚 ?细胞 二、病毒的动物培养 1、优点：对病毒敏感，可以培养其他方法无法培养的病毒，培养的病毒量大，可以用于研究病毒的致病作用等。 2、缺点：费用较大，不便于管理，容易造成环境污染。由于动物机体存在免疫力而干扰试验结果等。 三、猪瘟病毒的家兔培养 （一）步骤 1、家兔正常体温的测定：取2－3Kg健康雄家兔，每12h测定一次体温，连续测定6次，计算每只家兔平均正常体温。 2、病毒的接种：取犊牛睾丸细胞培养的猪瘟兔化弱毒疫苗，加入5mL灭菌生理盐水，5 000r/min离心10min，上清液注入家兔耳静脉，1mL/只。对照家兔注射1mL灭菌生理盐水。   （一）步骤 3、体温测定：接毒后分别在12、12、6、6、6、6、6、6h…测定家兔体温。 4、判定标准：从接毒时间算起，体温超过正常体温1℃或1℃以上连续3次或3次以上，判定为稽留热型。 （一）步骤 5、病毒收获：选择出现典型稽留热型的家兔，体温开始下降的24h内扑杀，无菌采取脾、淋巴结，加5倍体积的灭菌生理盐水及适量的抗生素，制成乳剂备用。 （一）步骤 6、乳兔接种与乳兔组织苗的制备：取出现典型稽留热成兔脾、淋种毒，离心去除沉淀，乳兔肌肉接种，1毫升/只，其间饲喂牛乳，每天三次。弃去24小时死亡乳兔，收取24－40小时之间死亡及未死乳兔于冰柜内冻死。 7、乳兔组织含毒鉴定：取乳兔组织离心上清，接种于成年家兔，同前法测温。 （二）结果 1、家兔正常体温常可达到39.5 ℃。 2、接种猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞培养病毒家兔常不出现体温升高，需要在家兔体内传代。 3、接种成年家兔脾淋毒常经过24小时的潜伏期后，开始体温升高，有时最多可以出现6个温次的体温稽留。 4、接种成年家兔脾淋毒的乳兔一般40小时不会死亡，制成的乳兔组织毒接种成年家兔仍可出现2次以上的稽留热。 （二）结果 四、病毒的鸡胚培养 1、优点：操作方便，来源容易，多数禽源病毒均可以在鸡胚中增殖，培养病毒量大，可以用于疫苗特别是禽类疫苗生产。 2、缺点：哺乳动物病毒对鸡胚敏感性较低，有时鸡胚可能携带来自种鸡病原。最好使用SPF鸡胚，但价格较高。 五、鸡新城疫病毒的鸡胚培养  1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫特定一种或几种疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。每2小时翻番一次。 2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。 （一）步 骤 （一）步 骤 3、接种与封孔：将NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释，接种鸡胚，0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。每日照蛋一次，弃去24小时或72h内死亡鸡胚，将72小时以后死亡的鸡胚置于冰箱内冷藏，至120h全部取出于4℃冰箱过夜。 （一）步 骤 4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。 5、HA效价测定：1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。血凝试验按下表操作： 250μL 250μL 。。。 250μL 250μL 250μL 1% RBC 250μL 250μL 。。。 250 L 250 L 250μL 收 获 尿囊液 250 μL 250 μL